Berita

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Sel-sel kanser telah mengembangkan pelbagai mekanisme untuk mengatasi tekanan selular dan terus berkembang.Protein kinase R (PKR) dan pengaktif proteinnya (PACT) adalah responden awal yang memantau pelbagai isyarat tekanan yang membawa kepada perencatan percambahan sel dan apoptosis.Walau bagaimanapun, peraturan laluan PACT-PKR dalam sel kanser masih tidak diketahui.Di sini, kami mendapati bahawa RNA bukan pengekodan panjang (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) terlibat secara langsung dalam perencatan laluan PACT-PKR dan menggalakkan percambahan sel kanser.Menggunakan saringan fungsi berskala besar CRISPRi 971 lncRNA berkaitan kanser, kami mendapati bahawa DARS-AS1 dikaitkan dengan percambahan sel kanser yang dipertingkatkan dengan ketara.Oleh itu, kalah mati DARS-AS1 menghalang percambahan sel dan menggalakkan apoptosis sel kanser dalam pelbagai saluran sel kanser secara in vitro dan dengan ketara mengurangkan pertumbuhan tumor dalam vivo.Secara mekanikal, DARS-AS1 mengikat terus ke domain pengaktifan PACT dan menghalang interaksi PACT-PKR, dengan itu mengurangkan pengaktifan PKR, fosforilasi eIF2α, dan menghalang kematian sel apoptosis.Secara klinikal, DARS-AS1 dinyatakan secara meluas dalam pelbagai kanser, dan overexpression lncRNA ini menunjukkan prognosis yang buruk.Kajian ini menjelaskan peraturan khusus kanser bagi laluan PACT-PKR oleh DARS-AS1 lncRNA dan menyediakan sasaran lain untuk prognosis dan rawatan kanser.
Keupayaan untuk menyesuaikan diri dengan tekanan adalah ciri penting kelangsungan hidup dan percambahan sel kanser.Percambahan pesat dan ciri metabolik kanser memuncak dalam persekitaran mikro yang teruk—kekurangan nutrien, hipoksia dan pH rendah—yang boleh mencetuskan laluan isyarat kematian sel.Disregulasi gen sensitif tekanan seperti p535, protein kejutan haba 6, 7, KRAS8, 9, dan HIF-110, 11, 12, 13 sering diperhatikan dalam kanser, dengan itu menyekat apoptosis dan menggalakkan kelangsungan hidup.
Protein kinase R (PKR) ialah sensor tekanan penting dan subunit kinase faktor permulaan eukariotik 2α (eIF2α), pengawal selia translasi yang menghubungkan tekanan selular kepada kematian sel.PKR pada asalnya dikenal pasti sebagai protein antivirus dengan pengesanan RNA untai dua (dsRNA) asing.Selepas pengaktifan, PKR memfosforilasi eIF2α untuk menghalang sintesis protein virus dan selular14,15,16.PACT (protein pengaktif PKR) telah dikenal pasti sebagai protein pengaktif PKR yang pertama jika tiada dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Melalui interaksi langsung dengan PKR, PACT memindahkan pelbagai tekanan (kebuluran serum, peroksida atau rawatan arsenit) kepada PKR dan laluan isyarat hiliran.Sebagai tambahan kepada fosforilasi eIF2α, pengaktifan PKR yang dimediasi PACT mencetuskan pelbagai peristiwa yang berkaitan dengan tindak balas tekanan, termasuk status redoks yang diubah melalui laluan PI3K/Akt24, pemeriksaan kerosakan DNA yang dipertingkatkan melalui p5325,26 dan NF-κB27,28 Mengawal transkripsi, 29. Memandangkan peranan kritikal mereka dalam tindak balas tekanan, percambahan, apoptosis dan proses selular utama yang lain, PKR dan PACT menjanjikan sasaran terapeutik untuk banyak penyakit, terutamanya kanser30,31,32,33.Walau bagaimanapun, di sebalik kepentingan fungsian dan biologi pleiotropik ini, peraturan aktiviti PACT/PKR dalam sel kanser masih sukar difahami.
lncRNA ialah transkrip yang lebih besar daripada 200 nukleotida tanpa potensi pengekodan protein.Memandangkan projek penjujukan genom keseluruhan yang canggih telah mengenal pasti beribu-ribu lncRNA, 35,36 banyak usaha telah dibuat untuk menjelaskan fungsi biologi mereka.Badan penyelidikan yang semakin berkembang telah menunjukkan bahawa lncRNA terlibat dalam banyak proses biologi37 termasuk pengawalan ketidakaktifan kromosom X38,39, pencetakan40, transkripsi41,42, terjemahan43 dan juga pertumbuhan kanser44,45,46,47.Kajian ini melaporkan bahawa banyak lncRNA terlibat dalam laluan PACT/PKR.Satu kajian sedemikian menunjukkan bahawa lncRNA ASPACT menghalang transkripsi PACT dan meningkatkan pengekalan nuklear mRNA PACT.Kajian lain telah menunjukkan bahawa lncRNA nc886 mengikat PKR dan menghalang fosforilasinya49,50.Setakat ini, lncRNA yang mengawal selia pengaktifan PKR yang dimediasi PACT belum dilaporkan.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) telah dikenal pasti sebagai lncRNA51,52,53,54 onkogenik.Melalui peraturan miP-194-5p53, miP-12952 dan miP-532-3p51, DARS-AS1 telah ditunjukkan untuk menggalakkan pertumbuhan karsinoma sel renal sel jernih, karsinoma tiroid dan karsinoma paru-paru bukan sel kecil.Tong dan rakan sekerja juga mendapati bahawa DARS-AS1 menggalakkan perkembangan myeloma dengan mengekalkan kestabilan motif pengikat RNA protein 39 (RBM39).Walau bagaimanapun, tiada kajian telah dijalankan sama ada lncRNA ini terlibat dalam pengawalseliaan pengaktifan PACT-PKR dan tindak balas tekanan sel kanser.
Di sini, kami melakukan skrin kehilangan fungsi berskala besar menggunakan sistem CRISPRi dan menentukan bahawa DARS-AS1 lncRNA menggalakkan percambahan beberapa jenis sel kanser.Di samping itu, kami telah mengenal pasti mekanisme utama: DARS-AS1 mengikat terus kepada PACT, menghalang pengikatan PACT dan PKR, menghalang fosforilasi eIF2α, substrat PKR yang lebih rendah, dan akhirnya menghalang kematian sel apoptosis.Kesimpulannya, kerja kami mendedahkan DARS-AS1 lncRNA sebagai pengawal selia laluan PACT-PKR dan sasaran yang berpotensi untuk rawatan dan prognosis kanser.
Kajian profil genomik yang meluas telah mengenal pasti beratus-ratus lncRNA yang dikaitkan dengan kanser.Walau bagaimanapun, fungsi mereka sebahagian besarnya masih tidak diketahui56.Untuk mengenal pasti calon lncRNA yang menjanjikan yang terlibat dalam perkembangan kanser, kami melakukan skrin kehilangan fungsi untuk mengurangkan percambahan dalam barisan sel kanser kolorektal SW620 menggunakan sistem CRISPRi (Rajah 1a).Ciri unik barisan sel kanser kolon SW480 dan SW620 ialah ia berasal daripada tumor primer dan sekunder dalam satu pesakit.Ini memberikan perbandingan yang berharga untuk mengkaji perubahan genetik dalam perkembangan kanser kolon lanjutan.Oleh itu, kami menganalisis transkrip sel sel kanser kolorektal (SW480 dan SW620) menggunakan penjujukan RNA dan mengumpul beberapa lncRNA berfungsi yang berpotensi daripada kesusasteraan yang diterbitkan.Berdasarkan keputusan ini, kami mereka bentuk perpustakaan sgRNA terkumpul yang mengandungi 7355 sgRNA oligos yang menyasarkan 971 lncRNA yang berkaitan dengan kanser dan 500 oligos sgRNA yang tidak disasarkan untuk kawalan negatif (Data Tambahan 1).
Perwakilan skematik saringan menggunakan sistem CRISPRi.b pengayaan sgRNA selepas pemeriksaan.Garis putus-putus mendatar mewakili log2 (perubahan kali ganda) = ±0.58.Garis putus-putus menegak menunjukkan nilai p = 0.05.Titik hitam mewakili sgRNA bukan sasaran (ditetapkan sebagai NC).Titik merah ialah sgRNA yang menyasarkan DARS-AS1.Titik biru ialah sgRNA yang menyasarkan LINC00205, lncRNA onkogenik yang diterangkan sebelum ini.perubahan lipat = (bacaan normal, hari 17)/(bacaan normal, hari 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown menghalang pertumbuhan sel.Bar ralat mewakili ± sisihan piawai bagi tiga eksperimen.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ujian-t pelajar dua hujung.d Ekspresi DARS-AS1 dalam tumor (set data TCGA).em Ungkapan DARS-AS1 dalam sampel normal dan tumor berpasangan daripada pesakit dengan BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, dan COAD, masing-masing (dataset TCGA).nilai-p diperoleh menggunakan ujian t Pelajar dua ekor berpasangan.
Selepas membina plasmid dan membungkus lentivirus, kami memindahkan barisan sel kanser kolorektal dCas9-SW620 dengan perpustakaan di atas dalam empat eksperimen jangkitan bebas.Kepelbagaian jangkitan (MOI) untuk jangkitan ini adalah 0.1-0.3, menunjukkan bahawa setiap sel hanya boleh ditransfeksi dengan satu sgRNA.Selepas 18 hari budaya in vitro, profil pengayaan sgRNA sasaran menurun atau meningkat selepas pemeriksaan, manakala bilangan oligonukleotida kawalan tidak disasarkan kekal tidak berubah berbanding profil pra-penyaringan, menunjukkan bahawa sasaran kami mempunyai skrin khusus yang sangat tinggi. perpustakaan.nasi.1b dan jadual tambahan 1). LINC00205, yang sebelum ini dilaporkan menggalakkan kanser paru-paru dan perkembangan kanser hati58,59,60, telah disaring (log2 (perubahan lipatan) <-0.58, nilai p <0.05), mengesahkan kebolehpercayaan pemeriksaan ini (Rajah 1b). LINC00205, yang sebelum ini dilaporkan menggalakkan kanser paru-paru dan perkembangan kanser hati58,59,60, telah disaring (log2 (perubahan lipatan) <-0.58, nilai p <0.05), mengesahkan kebolehpercayaan pemeriksaan ini (Rajah 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, sebelum ini dilaporkan menggalakkan perkembangan kanser paru-paru dan kanser hati58,59,60, telah dikecualikan (log2 (perubahan kali ganda) <-0.58, nilai p <0.05), mengesahkan keteguhan pemeriksaan ini (Rajah .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, P 值 <0.05), Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (log2 (倍数 变化) <-0.58, P 值 <0.05), LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, sebelum ini dilaporkan menggalakkan perkembangan kanser paru-paru dan hati58,59,60, telah dikecualikan (log2 (perubahan kali ganda) <-0.58, nilai p <0.05), mengesahkan keteguhan pemeriksaan ini (Rajah .1b).
Di antara semua lncRNA yang diuji, DARS-AS1 juga telah disaring, dengan tiga oligonukleotida sgRNA serumpun berkurangan dengan ketara selepas 18 hari kultur, menunjukkan bahawa ketukan lncRNA ini mengakibatkan percambahan kanser berkurangan (Rajah 1b).Keputusan ini disokong lagi oleh analisis MTS dalam sel kanser kolorektal yang menunjukkan bahawa kadar pertumbuhan sel knockdown DARS-AS1 hanya dibelah dua berbanding dengan sel kawalan (Rajah 1c) dan konsisten dengan laporan sebelumnya mengenai beberapa jenis kanser lain.: kanser buah pinggang sel jernih, kanser tiroid dan kanser paru-paru bukan sel kecil51,52,53,55.Walau bagaimanapun, fungsi dan mekanisme molekulnya dalam kanser kolorektal masih belum diterokai.Oleh itu, kami memilih lncRNA ini untuk kajian lanjut.
Untuk mengkaji ekspresi DARS-AS1 pada pesakit, kami menganalisis secara komprehensif 10,327 sampel tumor daripada projek Cancer Genome Atlas (TCGA).Keputusan kami menunjukkan bahawa DARS-AS1 dinyatakan secara meluas dan dikawal dengan ketara dalam sel-sel sihat dalam pelbagai tumor, termasuk adenokarsinoma kolon (COAD), karsinoma sel jernih buah pinggang (KIRC), dan karsinoma sel papillary renal (KIRP)..Sangat sedikit (Rajah 1d dan Rajah Tambahan 1a, b). Analisis sampel sihat/tumor berpasangan seterusnya mengesahkan ekspresi DARS-AS1 yang jauh lebih tinggi dalam tumor karsinoma urothelial pundi kencing (BLCA), karsinoma sel jernih buah pinggang (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus rahim (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoselular hati (LIHC), karsinoma sel papillary renal ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0.05) (Rajah 1e–m) . Analisis sampel sihat/tumor berpasangan seterusnya mengesahkan ekspresi DARS-AS1 yang jauh lebih tinggi dalam tumor karsinoma urothelial pundi kencing (BLCA), karsinoma sel jernih buah pinggang (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus rahim (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoselular hati (LIHC), karsinoma sel papillary renal ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0.05) (Rajah 1e–m) .Analisis sampel sihat/tumor berpasangan juga mengesahkan ekspresi DARS-AS1 yang jauh lebih tinggi dalam karsinoma urothelial pundi kencing (BLCA), karsinoma sel renal dan renal sel jelas (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), tumor karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , karsinoma endometrium korpus uteri (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoselular hati (LIHC), karsinoma sel papillary buah pinggang (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p < 0.05) (Rajah 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 Dars-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (LIHC), 肾 肾 肾 细胞癌 (KIRP) 和结肠腺癌 (Coad) (P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 表达, 内膜 癌 ((Ucel) 肺腺癌 (luad) 肝肝 细胞癌 (liHc)癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analisis sampel berpasangan sihat/tumor seterusnya menyokong peranan DARS-AS1 dalam karsinoma urothelial pundi kencing (BLCA), karsinoma sel renal sel jelas (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), dan tumor karsinoma sel skuamosa paru-paru (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresi dalam karsinoma rahim korpus (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoselular (LIHC), karsinoma sel papillary renal (KIRP), dan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p <0.05) (Rajah 1e -m).Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa DARS-AS1 secara meluas dan sangat dinyatakan dalam pelbagai jenis kanser.
Oleh kerana DARS-AS1 dan DARS (gen yang mengekodkan helai antisense) berkongsi promoter yang sama dan terletak bersebelahan antara satu sama lain, kami mereka bentuk shRNA untuk secara khusus menumbangkan DARS-AS1 tetapi bukan DARS (Tambahan Rajah 2a, b dan Jadual Tambahan 2) .Sebagai tambahan kepada SW620, kami juga menggunakan tiga baris sel lain yang sangat mengekspresikan DARS-AS1 untuk mengkaji keberkesanan dan fungsi shRNA knockdown (Jadual Tambahan 3).Keputusan kami menunjukkan bahawa ketiga-tiga shRNA yang dibangunkan mencapai sekurang-kurangnya 80% kecekapan knockdown DARS-AS1 dengan sedikit kesan ke atas jumlah mRNA DARS (Tambahan Rajah 2c–f).Di samping itu, kami mendapati bahawa DARS-AS1 knockdown dengan shRNA ini dengan ketara menghalang pertumbuhan sel dalam garisan sel kanser kolorektal SW620 (49.7%) dan HCT116 (27.7%), barisan sel kanser payudara MBA-MD-231 (53.4%).) dan garisan sel hepatoma HepG2 (pengurangan 92.7%), serta keupayaan mereka untuk membentuk sfera yang tidak bertali (pengurangan purata ~50.8%, 44.6%, 40.7% dan 75.7% setiap baris sel) (Rajah 2a, b).Dalam SW620, keputusan ujian pembentukan koloni seterusnya mengesahkan bahawa shRNA DARS-AS1 dengan ketara menghalang percambahan sel dengan penurunan purata kira-kira 69.6% (Rajah 2c).
Kesan kawalan shRNA dan DARS-AS1 shRNA pada percambahan sel (a) dan pembentukan spheroid (b) dalam sel SW620, HCT116, MBA-MD-231, dan HepG2.c Kesan kawalan shRNA dan DARS-AS1 shRNA pada pembentukan koloni dalam sel SW620.Proliferasi sel (d), pembentukan spheroid (e), dan pembentukan koloni (f) sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan.Data yang ditunjukkan ialah min ± sisihan piawai bagi tiga eksperimen.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, dan *** p ≤ 0.001 oleh ujian-t Pelajar dua hujung.
Untuk melengkapkan kajian kehilangan fungsi, kami seterusnya mencipta sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 (Tambahan Rajah 2g).Ekspresi berlebihan DARS-AS1 dengan ketara meningkatkan pertumbuhan sel (1.8 kali ganda), pembentukan spheroid tidak berchor (1.4 kali ganda), dan pembentukan koloni (3.3 kali ganda) dalam sel SW620 (Rajah 2d–f).Kami mengesahkan keputusan ini menggunakan satu lagi baris sel pengekspres DARS-AS1, A549.Percambahan sel yang dipertingkatkan ini disebabkan oleh overexpression DARS-AS1 selanjutnya diperhatikan dalam sel A549 (Tambahan Rajah 2h, i dan Jadual Tambahan 3).Diambil bersama, kajian untung rugi ini menunjukkan bahawa DARS-AS1 menggalakkan percambahan sel kanser secara in vitro.
Untuk meneroka mekanisme asas yang mana DARS-AS1 mengawal percambahan sel, kami melakukan analisis pull-down RNA untuk mengenal pasti rakan kongsi pengikat protein yang berpotensi.Keputusan RT-qPCR menunjukkan bahawa kira-kira 86.2% DARS-AS1 terletak dalam sitoplasma sel SW620 (Tambahan Rajah 3a).DARS-AS1 atau pseudoRNA yang ditranskripsi secara in vitro kemudian diinkubasi dengan lisat sel SW620 diikuti dengan pemisahan SDS-PAGE.Pewarnaan perak berikutnya menunjukkan bahawa jalur yang berbeza (~ 38 kDa) diperkaya dengan ketara dalam sampel tarik DARS-AS1 tetapi tidak dalam sampel RNA atau manik tiruan (Rajah 3a).Jalur ini dikenal pasti sebagai protein pengaktif PKR (PACT) oleh spektrometri jisim (MS) dan selanjutnya disahkan oleh immunoblotting dalam talian sel SW620, HCT116, dan HepG2 (Rajah 3a, b).Pengayaan DARS dan protein PACT yang berkaitan - PKR dan TRBP - juga disiasat menggunakan analisis RNA oleh Western blotting (WB).Keputusan menunjukkan bahawa tiada interaksi langsung antara DARS-AS1 RNA dan ketiga-tiga protein ini ditemui (Tambahan Rajah 3b).Interaksi khusus antara DARS-AS1 dan PACT telah disahkan lagi oleh analisis RNA immunoprecipitation (RIP), yang menunjukkan bahawa DARS-AS1 diperkaya dengan ketara dalam antibodi anti-PACT tetapi bukan RNA kawalan lain (Rajah 3c).Untuk menentukan sama ada DARS-AS1 berinteraksi secara langsung dengan PACT jika tiada komponen selular lain, ujian in vitro biolayer interferometry (BLI) dilakukan menggunakan PACT yang telah dimurnikan.DARS-AS1 atau RNA tiruan berlabel biotin telah digerakkan pada biosensor streptavidin (SA) dan kemudian diinkubasi dalam penimbal kinetik yang mengandungi 1 μM PACT.Terutama, PACT terikat kuat kepada DARS-AS1 (nilai KD ~ 26.9 nM), tetapi tidak meniru RNA (Rajah 3d).Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan interaksi langsung dan pertalian tinggi antara DARS-AS1 dan PACT.
Analisis tarikan RNA mengenal pasti DARS-AS1 berinteraksi dengan PACT dalam sel SW620.Di atas, pewarnaan perak protein berkaitan.Imunoblot yang lebih rendah dilakukan dengan antibodi anti-PACT.b Analisis pull-down RNA dilakukan dalam sel HCT116 (atas) dan HepG2 (bawah).Pengayaan PACT dikesan oleh immunoblotting.Ujian imunopresipitasi cRNA (RIP) dilakukan dalam sel SW620 menggunakan antibodi yang ditunjukkan.d Keluk mengikat PACT kepada DARS-AS1 atau RNA kawalan penuh diperolehi menggunakan interferometri biolayer (BLI).RNA telah digerakkan pada biosensor streptavidin.1 μM PACT digunakan untuk mengukur persatuan.Ujian tarikan RNA dilakukan menggunakan DARS-AS1 penuh biotinilasi atau dipotong (atas).Imunoblot yang menunjukkan PACT diterima (bawah).f PACT berbendera yang telah disucikan telah diinkubasi dengan DARS-AS1 penuh biotinilasi atau dipotong (seperti dalam e) untuk ujian RIP in vitro.RNA yang diekstrak telah disahkan oleh RT-qPCR.g Pertalian relatif serpihan RNA yang berbeza untuk PACT diperoleh menggunakan interferometri biolayer.Untuk analisis, 100 nM RNA dan 1 μM RAST digunakan.h Ujian RIP in vitro dilakukan menggunakan PACT berlabel utuh atau terpotong.RNA yang diekstrak telah disahkan oleh RT-qPCR.i Kadar pertumbuhan sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1, PACT atau kedua-duanya.j Ekspresi berlebihan DARS-AS1 panjang penuh atau terpotong dalam sel SW620 mempunyai kesan yang berbeza pada pertumbuhan sel.k Apoptosis dikesan dengan immunoblotting dengan antibodi anti-PARP.l Kalah mati DARS-AS1 mendorong apoptosis sel SW620 seperti yang ditunjukkan oleh sitometri aliran.Data yang ditunjukkan ialah min ± sisihan piawai bagi tiga eksperimen. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, dengan ujian t Pelajar dua ekor. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, dengan ujian t Pelajar dua ekor. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 dengan ujian-t Pelajar dua hujung. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 dengan ujian-t Pelajar dua hujung.
Kami kemudiannya menghasilkan tiga serpihan RNA DARS-AS1 biotinilasi dengan transkripsi in vitro untuk mengenal pasti rantau DARS-AS1 yang diperlukan untuk persatuan PACT (Rajah 3e).Keputusan analisis RNA menunjukkan bahawa setiap serpihan dapat berinteraksi dengan PACT, tetapi rantau 3'-terminal (384-768 nukleotida berlabel A3) menunjukkan lebih daripada 1-384 nukleotida berlabel A1) (Rajah 3e).Keputusan yang sama diperhatikan dalam ujian RIP in vitro menggunakan PACT rekombinan (Rajah 3f).Selaras dengan keputusan ini, eksperimen untuk mengikat serpihan RNA tidak bergerak kepada PACT menggunakan BLI juga menunjukkan bahawa PACT mempunyai pertalian yang lebih tinggi untuk A3 (384-768 nt) (nilai KD kira-kira 94.6 nM), manakala hampir tiada pautan dengan kawasan lain.(Gamb. 3d).
Kami juga memeriksa kawasan mengikat yang berkaitan dalam PACT.PACT mengandungi tiga domain fungsian, dua daripadanya ialah domain pengikat RNA berkantai dua (dsRBD) dan domain ketiga (ditetapkan D3) yang bertindak sebagai pengaktif interaksi protein.Untuk memeriksa kapasiti pengikatan lncRNA bagi setiap domain, kami merekayasa tiga mutasi yang mengalih keluar setiap tiga domain dan melakukan ujian RIP in vitro.Keputusan kami menunjukkan bahawa pemadaman domain ketiga (D3) PACT dengan ketara mengurangkan interaksinya dengan DARS-AS1 (sebanyak 0.11 kali ganda berbanding dengan PACT utuh) berbanding dengan dua mutasi lain (Rajah 3h), ditunjukkan bahawa pelepasan itu D3 berinteraksi dengan DARS.-AC1.Diambil bersama, keputusan ini mencadangkan bahawa interaksi antara DARS-AS1 dan PACT mungkin berlaku terutamanya melalui penghujung 3' DARS-AS1 dan domain D3 PACT.
Kami menyatakan bahawa DARS-AS1 tidak mempunyai kesan ke atas ekspresi PACT dan PACT tidak mempunyai kesan ke atas DARS-AS1 (Tambahan Rajah 3c).Kami kemudiannya mengkaji kesan knockdown PACT pada pertumbuhan sel.Berbeza dengan DARS-AS1, sel relatif berkembang 1.5-3 kali lebih cepat apabila PACT dirobohkan (Tambahan Rajah 3d).Keputusan ujian pembentukan koloni menunjukkan bahawa sel membentuk koloni 2-3 kali ganda selepas rawatan shRNA dengan PACT (Tambahan Rajah 3e).Untuk menguji sama ada DARS-AS1 mengawal percambahan sel melalui PACT, kami menjana sel SW620 yang mengekspresikan PACT, DARS-AS1 atau kedua-duanya.Ekspresi berlebihan PACT menunjukkan perencatan ketara percambahan sel (Rajah 3i).Walaupun overexpression DARS-AS1 per se secara signifikan menggalakkan percambahan sel, tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam kadar pertumbuhan sel yang terlalu mengekspresikan DARS-AS1 dan PACT.Keputusan ini menunjukkan bahawa PACT boleh mengatasi peningkatan percambahan yang disebabkan oleh overexpression DARS-AS1.
Oleh kerana kawasan DARS-AS1 yang berlainan mempunyai kebolehan mengikat PACT yang berbeza, kami menyiasat pengaruh relatifnya terhadap percambahan sel dengan ekspresi berlebihan serpihan DARS-AS1 yang berbeza.Berbanding dengan dua serpihan lain, DARS-AS1 telah diekspresikan secara berlebihan pada hujung 3' (384-768 nt), kawasan berkaitan PACT utama dalam DARS-AS1, yang mempunyai keupayaan tertinggi untuk merangsang percambahan sel (Rajah 3j).Keputusan ini menunjukkan korelasi positif antara kapasiti mengikat dan fungsi biologi DARS-AS1.
PACT telah dilaporkan sebagai protein pro-apoptosis19.Oleh itu, kami menyiasat kesan DARS-AS1 pada apoptosis.Seperti yang dijangkakan, knockdown DARS-AS1 dengan ketara meningkatkan belahan PARP dalam sel SW620 dan meningkatkan perkadaran sel positif annexin V dalam SW620, HCT116, HepG2 dan barisan sel MBA-MD-231 (Rajah 3k).3).3f-h), menunjukkan bahawa kesan anti-apoptosis DARS-AS1 dalam sel kanser adalah bertentangan dengan fungsi PACT yang mendorong apoptosis.Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa mekanisme fungsi onkogenik DARS-AS1 mungkin melalui perencatan fungsi PACT.
Seterusnya, kami meneroka implikasi fungsi persatuan DARS-AS1-PACT.PACT telah dilaporkan untuk mengaktifkan PKR melalui interaksi langsung, yang kemudiannya meningkatkan fosforilasi eIF2α, menyebabkan penghapusan translasi dan apoptosis17.Pertama, kami mengkaji sama ada DARS-AS1 menjejaskan penyetempatan selular PACT dan PKR.Mikroskopi pendarfluor konfokal menunjukkan bahawa PACT dan PKR sangat kolokalisasi dalam sel SW620 dengan purata pekali korelasi Pearson sebanyak 0.72.Sementara itu, ekspresi berlebihan DARS-AS1 dengan ketara mengurangkan penyetempatan bersama PACT dan PKR (min pekali korelasi Pearson 0.61) (Rajah 4a).Untuk menyiasat sama ada DARS-AS1 boleh memodulasi interaksi PACT-PKR, kami melakukan ujian co-imunoprecipitation (co-IP) dengan antibodi anti-PACT dalam lisat sel SW620.PKR sangat diperkaya dengan anti-PACT dalam sel kawalan, manakala pemulihan PKR dikurangkan dengan ketara dalam lisat daripada sel yang terlalu mengekspresikan DARS-AS1 (Rajah 4b).PACT dan PKR berlabel yang telah dimurnikan digunakan untuk ujian mengikat protein in vitro.Sehubungan itu, mereka yang menyediakan DARS-AS1 tetapi tiada RNA kawalan menunjukkan interaksi PACT-PKR yang ditindas (Rajah 4c).Semua keputusan menunjukkan DARS-AS1 mengganggu komunikasi PACT dan PKR.
Penyetempatan bersama PACT dan PKR dalam sel kawalan atau sel yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan diperhatikan menggunakan mikroskop pendarfluor confocal.Nukleus telah dicemari dengan DAPI.Keputusan statistik diperolehi daripada 16 gambar.b Co-imunoprecipitation (co-IP) menggunakan antibodi anti-PACT dalam lisat sel kawalan sel SW620 atau sel yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan.c PACT berlabel, PKR yang disucikan dan ditranskripsi secara in vitro dengan DARS-AS1 atau RNA olok-olok telah diinkubasi untuk analisis pengikatan protein in vitro.Antibodi anti-bendera digunakan untuk imunopresipitasi.d Imunoblot dengan antibodi yang ditunjukkan telah dilakukan dalam sel SW620 dan HCT116 yang ditransfeksi dengan shRNA kawalan atau DARS-AS1-shRNA diikuti oleh kebuluran serum.e Tahap ekspresi DARS-AS1 mengubah sensitiviti selular kepada thapsigargin.Sel SW620 telah ditransfeksi dengan DARS-AS1 shRNA, plasmid overexpression DARS-AS1 atau plasmid kawalan.Sel telah dirawat dengan thapsigargin selama 48 jam dan daya maju sel ditentukan menggunakan reagen MTS.f DARS-AS1 yang ditranskripsi secara in vitro atau RNA tiruan dan PACT yang telah dimurnikan digunakan untuk ujian pengaktifan in vitro dan pengesanan imunoblot.g Imunoblot menggunakan antibodi ini dilakukan pada sel SW620-ctrl (kiri) atau sel yang mengekspresikan mutan PKR secara berlebihan (kanan).Sel-sel ini kemudiannya ditransfeksi dengan shRNA kawalan atau DARS-AS1-shRNA diikuti dengan kebuluran serum.h Sitometri aliran menunjukkan bahawa ketidakaktifan PKR mutan mengimbangi apoptosis yang disebabkan oleh DARS-AS1 dalam sel SW620.i Imunoblot dengan antibodi yang ditunjukkan telah dilakukan dalam sel SW620 (kiri) atau HCT116 (kanan).Sel yang ditransfeksi dengan shRNA kawalan atau shRNA DARS-AS1 adalah kekurangan serum dan ditambah dengan 100 nM PKR C16 inhibitor atau DMSO.Bar skala = 5 µm.Data yang ditunjukkan ialah min ± sisihan piawai bagi tiga eksperimen.* p ≤ 0.05 ujian-t pelajar dua hujung.
Umumnya dipercayai apabila PACT berinteraksi dengan PKR17, fosforilasi PKR pada Thr451 boleh didorong.Keputusan kami menunjukkan bahawa tahap fosforilasi PKR telah meningkat dengan ketara dalam sel knockdown DARS-AS1 selepas kebuluran serum (Rajah 4d dan Rajah Tambahan 4a).Sehubungan itu, kami mendapati bahawa fosforilasi eIF2α, substrat utama PKR, juga meningkat dengan ketara oleh DARS-AS1 shRNA (Rajah 4d dan Tambahan Rajah 4a).Thapsigargin ialah tekanan ER yang menyebabkan ER mengeluarkan Ca2+.Rawatan dengan thapsigargin telah dilaporkan untuk mendorong ekspresi dan pengaktifan PACT, yang seterusnya berinteraksi dengan dan mengaktifkan PKR, yang membawa kepada apoptosis dengan meningkatkan fosforilasi eIF2α 18,61 .Di sini, kami menggunakan thapsigargin sebagai perangsang laluan PACT/PKR untuk menyiasat sama ada DARS-AS1 boleh membantu sel mengatasi tekanan dengan menghalang laluan PACT/PKR.Kami mendapati bahawa tahap ekspresi DARS-AS1 berkorelasi positif dengan rintangan sel kepada thapsigargin.Sel SW620 yang mengekspresikan DARS-AS1 secara berlebihan bertahan lebih baik apabila dirawat dengan thapsigargin, manakala sel dengan knockdown DARS-AS1 menjadi lebih mudah terdedah (Rajah 4e).Selaras dengan keputusan ini, ekspresi berlebihan DARS-AS1 mengurangkan fosforilasi PKR yang disebabkan oleh thapsigargin (Tambahan Rajah 4b).Sebaliknya, selepas rawatan thapsigargin, PKR dan eIF2α telah difosforilasi ke tahap yang lebih tinggi dalam sel knockdown DARS-AS1 berbanding sel kawalan (Tambahan Rajah 4b).Menariknya, thapsigargin mendorong ekspresi DARS-AS1 dalam cara yang bergantung kepada dos, yang mungkin menunjukkan fungsi anti-tekanan DARS-AS1 (Tambahan Rajah 4c).Di samping itu, kami melakukan ujian pengaktifan in vitro untuk mengesahkan pemerhatian ini.Secara ringkas, PKR telah disucikan daripada lisat sel menggunakan antibodi anti-PKR, kemudian diinkubasi dengan PACT rekombinan dan DARS-AS1 yang ditranskripsi secara in vitro.Selepas tindak balas enzimatik, fosfo-PKR dikesan menggunakan WB.Keputusan kami menunjukkan bahawa fosforilasi PKR telah dihalang dengan ketara oleh DARS-AS1, tetapi bukan oleh RNA kawalan (Rajah 4f).Keputusan in vitro dan in vivo ini menunjukkan bahawa DARS-AS1 menghalang pengaktifan PKR yang dimediasi PACT.Pada masa yang sama, kami juga melihat penurunan dalam pemulihan PACT dengan kehadiran DARS-AS1 (Rajah 4f).Keputusan ini konsisten dengan keputusan ujian pengikatan protein in vitro (Rajah 4c) dan sekali lagi menggambarkan fungsi penyekatan DARS-AS1 untuk persatuan PACT-PKR.
Ser246 dan Ser287 dalam domain D3 PACT diperlukan untuk pengaktifan PKR di bawah tekanan selular.Penggantian dua residu serin untuk alanine memberikan PACT mutan (mutD), yang mengaktifkan PKR tanpa tekanan, dan penggantian untuk alanine (mutA) membalikkan protokol.Oleh kerana kami telah menunjukkan kepentingan domain ini dalam hubungan langsung dengan DARS-AS1, kami menghasilkan dua mutan PACT ini untuk menguji sama ada residu ini juga boleh terlibat dalam interaksi dengan DARS-AS1.Menariknya, kedua-dua mutan kehilangan keupayaan untuk mengikat DARS-AS1 (Tambahan Rajah 4d), menunjukkan bahawa struktur lengkap protein PACT mungkin diperlukan untuk interaksi yang cekap dengan DARS-AS1.
Tambahan pula, keputusan kami juga mencadangkan bahawa perencatan DARS-AS1-shRNA yang disebabkan oleh percambahan sel boleh dipulihkan sebahagiannya dengan mengekspresikan mutan PACT negatif dominan (PACTmutA) atau mutan PKR negatif dominan (PKRmut) (Tambahan Rajah 4e. e).Ekspresi berlebihan mutan PKR dominan-negatif mengurangkan fosforilasi PKR yang disebabkan oleh knockdown DARS-AS1 serta fosforilasi eIF2α dalam sel kekurangan serum (Rajah 4g).Lebih penting lagi, perkadaran sel apoptosis yang disebabkan oleh knockdown DARS-AS1 juga dikurangkan dalam sel yang mengekspresikan PKRmut secara berlebihan (Rajah 4h dan Rajah Tambahan 4g).Perencatan aktiviti kinase PKR juga menjejaskan fungsi DARS-AS1, kerana keputusan menunjukkan bahawa knockdown DARS-AS1 jarang mencetuskan fosforilasi PKR dan eIF2α apabila sel dirawat dengan perencat C16 khusus PKR (Rajah 4i dan Rajah Tambahan 4h).).Diambil bersama, keputusan kami mencadangkan bahawa DARS-AS1 menggalakkan percambahan sel, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dengan menghalang pengaktifan PKR yang dimediasi PACT.
Untuk meneroka lebih lanjut peranan DARS-AS1 dalam tumorigenesis, kami melakukan eksperimen dalam vivo menggunakan model xenograf tetikus. Keputusan menunjukkan bahawa ketukan DARS-AS1 secara mendadak menurunkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0.0001) (Rajah 5a). Keputusan menunjukkan bahawa ketukan DARS-AS1 secara mendadak menurunkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0.0001) (Rajah 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (contoh 5а). Keputusan menunjukkan bahawa knockdown DARS-AS1 secara drastik mengurangkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0.0001) (Rajah 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (contoh 5а). Keputusan menunjukkan bahawa ketukan DARS-AS1 dengan ketara mengurangkan pertumbuhan tumor pada tikus (nilai p <0.0001) (Rajah 5a).Oleh itu, dalam kumpulan knockdown DARS-AS1, terdapat penurunan ketara dalam jumlah tumor purata sebanyak kira-kira 72.9% dan jisim tumor min sebanyak kira-kira 87.8% (Rajah 5b-d).Keputusan ini sangat mencadangkan bahawa DARS-AS1 boleh menggalakkan pertumbuhan tumor dengan ketara dalam vivo.
Kesan iklan DARS-AS1 knockdown pada onkogenesis kolorektal dalam tikus bogel.Lengkung pertumbuhan (a), saiz tumor (b), berat (c), dan imej tumor (d) ditunjukkan.Bar ralat mewakili ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, dengan ujian t Pelajar dua hujung. n = 10. ****p < 0.0001, dengan ujian t Pelajar dua hujung. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 ujian-t Pelajar dua hujung.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 ujian-t Pelajar dua hujung.e Kaplan-Meier menganalisis korelasi antara tahap ekspresi DARS-AS1 dan kelangsungan hidup keseluruhan pada pesakit dengan UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, dan LGG.Tahap tinggi ekspresi DARS-AS1 pada pesakit berada dalam 50% teratas;tahap rendah ekspresi DARS-AS1 pada pesakit berada di bawah 50%.nilai-p ditentukan menggunakan ujian pangkat log.f Model yang dicadangkan di mana DARS-AS1 mengawal laluan PACT-PKR dan pertumbuhan tumor.
Untuk lebih memahami kesan klinikal DARS-AS1, kami mengkaji korelasi antara ekspresinya dan kelangsungan hidup pesakit.Dengan menganalisis dataset TCGA, kami mendapati bahawa ekspresi DARS-AS1 yang lebih tinggi dikaitkan dengan melanoma uveal (UVM), chromophobia renal (KICH), karsinoma sel papillary renal (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Kelangsungan hidup yang lebih rendah dikaitkan dengan morfosis glioblastoma (GBM) dan pesakit dengan glioma otak gred rendah (LGG) (Rajah 5e).Keputusan ini menunjukkan bahawa DARS-AS1 mungkin memainkan peranan penting dalam perkembangan tumor klinikal dan mungkin menjadi biomarker ramalan yang berpotensi dalam pelbagai kanser.
Dalam kajian ini, menggunakan saringan fungsi CRISPRi berskala besar, kami menentukan bahawa DARS-AS1 lncRNA mengatasi tekanan sel kanser dengan mengawal selia dua responden tekanan utama, PACT dan PKR.Dengan berinteraksi secara langsung dengan PACT, DARS-AS1 menghalang pengaktifan PKR yang dimediasi PACT, dengan itu menghalang kematian sel apoptosis dan menggalakkan percambahan sel (Rajah 5f).Penyelarasan DARS-AS1 telah diperhatikan dalam pelbagai jenis kanser, menunjukkan bahawa fungsinya untuk menggalakkan kelangsungan hidup sel kanser di bawah keadaan tekanan mungkin boleh digunakan secara meluas untuk pelbagai jenis kanser.
PACT telah dikenal pasti sebagai protein pengaktif PKR, dan pengaktifan PKR yang dimediasi PACT memainkan peranan penting dalam tindak balas tekanan dengan mengawal selia transkripsi, terjemahan, apoptosis dan proses selular penting yang lain62.Selama beberapa dekad, percubaan telah dibuat untuk memahami peraturan khusus kanser bagi lata PACT-PKR.Di sini, kajian kami mendedahkan mekanisme pengawalseliaan PACT-PKR yang berbeza dalam sel kanser melalui lncRNA DARS-AS1 selular, yang secara langsung mengikat PACT, menyekat interaksi PACT-PKR, menghalang pengaktifan PKR dan fosforilasi eIF2α, dengan itu menghalang apoptosis yang disebabkan oleh tekanan dan merangsang percambahan kanser akhirnya.sel.Penemuan ini memberi penerangan tentang sasaran lncRNA yang berpotensi untuk prognosis dan terapi kanser.
Data kami menunjukkan bahawa ketukan DARS-AS1 menjadikan sel sensitif kepada kebuluran serum dengan peningkatan ketara dalam PKR terfosforilasi dan eIF2α.Keputusan ini menunjukkan bahawa DARS-AS1 menggalakkan kelangsungan hidup sel kanser dalam keadaan yang teruk dengan menghalang aktiviti PACT/PKR.Beberapa RNA bukan pengekodan lain, seperti ASPACT dan nc886, juga terlibat dalam paksi PACT/PKR dengan menurunkan kawal selia mRNA PACT48 atau mengawal selia autofosforilasi dengan mengikat PKR49,50,64.Antaranya DARS-AS1 bertindak sebagai pengacau persatuan PACT-PKR.Kajian ini memperkaya pemahaman kita tentang peraturan paksi PACT/PKR dan peranan lncRNA dalam tindak balas tekanan.
PACT mengandungi tiga domain berasingan.Setiap satu daripada dua dsRBD pertama adalah mencukupi untuk mencapai pengikatan pertalian tinggi PACT kepada PKR, manakala domain ketiga (D3) diperlukan untuk pengaktifan PKR secara in vitro dan in vivo.Kajian kami menunjukkan bahawa DARS-AS1 lebih suka berinteraksi dengan domain D3 (Rajah 3h).Memandangkan saiz lncRNA yang besar (768 nukleotida), DARS-AS1 yang mengikat D3 secara fizikal boleh menghalang interaksi antara domain PACT dsRBD dan PKR, dengan itu menyekat persatuan PACT dan PKR.Mutasi titik PACT yang menggantikan Ser246 dan Ser287 dalam D3 dengan alanin atau aspartat mengganggu pertalian pengikatnya untuk DARS-AS1, menunjukkan kepentingan sifat struktur dan elektrik keseluruhan D3 dalam persatuan mereka.Butiran lanjut mengenai mekanisme ini akan diperlukan pada masa hadapan, menggunakan analisis biokimia yang lebih tepat dan analisis struktur PACT resolusi tinggi.
Kajian terdahulu telah melaporkan bahawa DARS-AS1 menggalakkan percambahan sel melalui beberapa mekanisme51,52,53.Dalam satu contoh, penyiasat mendapati bahawa DARS-AS1 mengawal selia gen DARS pengekodan protein antisensenya dengan menyasarkan miP-194-5p dalam sel kanser buah pinggang.Walau bagaimanapun, dalam kajian ini, knockdown DARS-AS1 mempunyai sedikit kesan pada transkripsi DARS dalam pelbagai jenis kanser, termasuk sekurang-kurangnya kanser kolorektal, payudara, dan hati.Oleh kerana lncRNA mempamerkan corak ekspresi khusus sel dan tisu, mekanisme berfungsi mungkin tidak dipelihara merentas jenis kanser, yang mungkin menyumbang kepada percanggahan ini antara pemerhatian kami dan penilaian terdahulu terhadap kanser yang berbeza.Kajian khas diperlukan untuk menjelaskan mekanisme khusus pelbagai proses fisiologi dan patologi.
Analisis data klinikal menunjukkan bahawa ekspresi DARS-AS1 dalam tumor berkorelasi songsang dengan kelangsungan hidup pesakit kanser, yang menggariskan kepentingan paksi DARS-AS1/PACT/PKR dalam prognosis kanser.Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa DARS-AS1 ialah pengawal selia paksi isyarat PACT/PKR, menggalakkan percambahan sel kanser, dan menghalang apoptosis semasa tindak balas tekanan, yang menyediakan satu lagi penyelidikan dan menarik untuk penyelidikan masa depan terhadap rawatan yang berpotensi. .
Talian sel manusia SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 dan HEK293T diperoleh daripada Infrastruktur Sumber Talian Sel Nasional di China.Semua sel dikekalkan dalam medium DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ditambah dengan 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) dan 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) pada 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Bendera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosforus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);IgG tetikus biasa, CST (5415S);IgG arnab biasa, CST (2729S).Antibodi telah dicairkan 1:1000 dalam PBST untuk Western blotting dan 1:100 untuk IP.
sgRNA telah dibangunkan menggunakan alat yang tersedia secara umum dipanggil CRISPR-ERA66.Kami menggunakan parameter alat lalai untuk pembangunan sgRNA dan algoritma mengira tapak mengikat sgRNA di rantau 3 kb.berpusat di TSS.Kumpulan oligonukleotida sgRNA telah disintesis di CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) dan diklonkan ke dalam plasmid pgRNA yang dimanusiakan (Addgene #44248).Sebanyak 12 µg plasmid pgRNA manusiawi terkumpul, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), dan 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) telah ditransfeksi bersama ke dalam piringan 5 x 106 HEK293T dalam 106 HEK293T Transfection dalam DNAagent Transfection. sel ( CWBIO, Beijing, China) mengikut arahan pengilang.Supernatan yang mengandungi virus dikumpul 48 dan 72 jam selepas pemindahan dan ditapis melalui penapis 0.45 µm.Untuk pemeriksaan, sel SW620 yang mengekspresikan protein gabungan dCas9/KRAB diperoleh melalui transduksi virus.Sel SW620 yang diubah suai telah dijangkiti dengan perpustakaan virus dalam empat eksperimen jangkitan bebas pada MOI 0.1-0.3 dan telah diambil sampel dengan 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) selama 2 hari.Selepas itu, sel telah dibiakkan selama 18 hari secara in vitro dengan liputan perpustakaan minimum sebanyak 500 sel/sgRNA untuk pemeriksaan.
DNA genomik diekstrak mengikut arahan Kit Midi Darah DNA QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, Jerman; 51183).Secara keseluruhan, 100 μg DNA genom setiap ulangan biologi digunakan untuk membina perpustakaan.Rantau sgRNA telah dikuatkan oleh dua pusingan PCR dan dikaitkan dengan kod bar.
Produk PCR telah ditulenkan menggunakan gel NucleoSpin® dan kit penulenan PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jerman; 740609.250) dan dikira menggunakan kit pengesanan DNA untai dua Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ujian MTS digunakan untuk mengukur percambahan sel.Sel telah disemai dalam plat 96-telaga pada ketumpatan awal 2000 sel/telaga.Bilangan relatif sel diukur setiap hari pada masa yang dinyatakan selama 4-6 hari.Bagi setiap telaga, 20 μl reagen MTS (Promega) dicairkan dengan 100 μl DMEM, diinkubasi dengan sel selama 4 jam pada 37 ° C, dan kemudian OD490 diukur.
Keupayaan untuk pertumbuhan yang tidak bertali telah ditemui dengan menganalisis pembentukan sfera.Secara ringkas, 2000 sel yang ditransfeksi dengan shRNA DARS-AS1 atau shRNA kawalan telah dibiakkan dalam microplates lampiran ultra rendah (Corning) dengan perubahan sederhana setiap 4 hari.Spheroid dikira selepas 14 hari.500 sel yang ditransfeksi dengan plasmid overexpression DARS-AS1 atau plasmid kawalan telah digunakan untuk ujian peningkatan, jika tidak kaedahnya tidak berubah.
RNA telah ditranskripsi menggunakan T7 RNA polymerase dan biotin-16-UTP (Roche 1138908910) mengikut arahan Sistem Gabungan Riboprobe® (Promega P1440).Primer yang digunakan di sini disenaraikan dalam Jadual Tambahan 4.
PACT atau wilayah PKR pengekodan protein telah diklonkan ke pET15b (Addgene #73619) dan diubah menjadi BL21(DE3).Bakteria diinkubasi semalaman dalam LB yang dibekalkan dengan ampisilin dan kemudian dicairkan 100 kali ganda dengan LB segar.Apabila OD600 medium mencapai 0.8, 1 mM IPTG telah ditambah untuk mendorong ekspresi protein.Selepas pengeraman semalaman dengan goncangan lembut (250 rpm pada 20°C), pelet sel dikumpul dengan sentrifugasi (4000 rpm, 10 min, 4°C).Gantungkan semula pelet sel dalam penimbal lisis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) dan eramkan pada ais selama 30 minit, kemudian sonicate (15 min, 5 saat hidup/mati, pada ais) dan emparan (13,000). rpm)., 30 min, 4°C).Supernatan kemudiannya dimuatkan ke dalam resin Ni-NTA (QIAGEN) 3 kali pada 4°C, dibasuh 4 kali dengan penimbal pencuci (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) dan dielusi 3 kali, dengan jumlah daripada 10 ml penimbal eluen (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Protein yang telah disucikan ditentukan menggunakan WB dan kepekatannya ditentukan menggunakan kit ujian protein Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Ujian RIP dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini, dengan pengubahsuaian.Secara ringkas, 1x penimbal RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, perencat Rnasin ribonuclease (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) melisiskan koktel sitostatik 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) dan sentrifuge pada 13,000 rpm selama 15 minit pada 4 °C.Supernatan itu kemudiannya diinkubasi dengan manik magnetik A+G protein (Millipore) yang digabungkan dengan 5 μg antibodi anti-PACT (Abeam) atau IgG (CST).Manik telah dibasuh 5 kali dengan penimbal RIP 5x, kemudian dicerna dengan proteinase K (NEB).RNA diekstrak dengan Trizol dan ditentukan oleh RT-qPCR.Primer dibentangkan dalam Jadual Tambahan 5.
Ujian RIP in vitro dilakukan mengikut protokol ujian RIP standard yang diubah suai.Sebanyak 5 pmol RNA yang ditranskripsi secara in vitro telah dicairkan 1x dengan penimbal RIP dan disepuh dengan inkubasi pada suhu 65°C selama 5 minit diikuti dengan penyejukan perlahan ke suhu bilik.Sebanyak 5 pmol protein PACT berlabel bendera utuh atau bermutasi telah disucikan daripada E. coli.Inkubasi dengan RNA yang diubah suai selama 2 jam pada suhu 4°C dan ikuti prosedur di atas untuk analisis RIP untuk IP anti-bendera.
Untuk analisis sambungan RNA, 1 × 107 sel telah dilisiskan dengan penimbal 1xRIP.Selepas sentrifugasi pada 13,000 rpm selama 15 minit pada 4 ° C, supernatan telah dirawat terlebih dahulu dengan 30 μl manik magnet streptavidin (Beckman) selama 2 jam pada 4 ° C.Lisat yang telah disucikan kemudiannya dibekalkan dengan tRNA yis dan diinkubasi dengan 40 pmol RNA yang telah diubahsuai semalaman pada suhu 4 ° C, kemudian selama 2 jam lagi dan 20 μl manik magnet streptavidin baru yang disekat dengan BSA telah ditambah.Langkah mencuci terdiri daripada 4 kali dengan 5x RIP buffer dan 4 kali dengan 1x RIP buffer.Protein yang sepadan telah dielusi dengan penimbal elusi biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) dan diasingkan pada NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Selepas pewarnaan perak (Bioteknologi Beyotime), jalur tertentu telah dikeluarkan dan dianalisis oleh MS.
Analisis Co-IP dilakukan untuk menguji interaksi antara PACT dan PKR.Secara ringkas, lisat supernatan telah disediakan dengan mengeramkan 1 x 107 sel terlisis dalam 1 x penimbal RIP diikuti dengan sentrifugasi pada 13,000 rpm selama 15 minit pada suhu 4°C.Lysates dimuatkan dengan protein A + G manik magnet, dikonjugasikan dengan 5 µg antibodi anti-PACT, dan perlahan-lahan diputar semalaman pada suhu 4°C.Manik telah dibasuh 3 kali dengan penimbal 5×RIP, dua kali dengan penimbal 1×RIP dan dielusi dengan penimbal 1×SDS.Protein yang dipulihkan dianalisis oleh gel SDS-PAGE dan dikesan oleh WB.
Dua pmol PACT berbendera dan 1 pmol PKR telah disucikan daripada E. coli.Cairkan dalam penimbal 1× RIP dan eramkan dengan 10 pmol RNA yang telah diubahsuai selama 2 jam pada suhu 4 °C.Selepas itu, mereka diinkubasi dengan antibodi anti-label terkonjugasi manik magnet A+G protein selama dua jam tambahan.Manik-manik itu kemudiannya dibasuh empat kali dengan penimbal RIP 1x dan dielusi dengan penimbal SDS 1x.PACT dan PKR yang terhasil telah dikesan oleh WB.