Berita

Terima kasih kerana melawat Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau lumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan menjadikan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Kaedah pelabelan kedekatan enzimatik berdasarkan ester diaktifkan atau radikal fenoksi digunakan secara meluas untuk memetakan proteom subselular dan interaksi protein dalam sel hidup.Walau bagaimanapun, ester yang diaktifkan kurang reaktif, menghasilkan jejari pelabelan yang luas, dan radikal fenoksi yang dihasilkan oleh rawatan peroksida boleh mengganggu laluan redoks.Di sini kami melaporkan kaedah photoactivation bergantung pelabelan kedekatan (PDPL) yang dibangunkan dengan menghubungkan secara genetik protein fotosensitizer miniSOG kepada protein yang menarik.Dicetuskan oleh cahaya biru dan dikawal oleh masa pendedahan, oksigen singlet dijana dan kemudian pelabelan sisa histidin yang diselesaikan secara spatiotemporal oleh probe aniline dicapai.Kami menunjukkan kesetiaannya yang tinggi melalui pemetaan proteom khusus organel.Perbandingan sebelah menyebelah PDPL dengan TurboID menunjukkan liputan proteomik PDPL yang lebih khusus dan komprehensif.Seterusnya, kami menggunakan PDPL kepada coactivator transkripsional yang berkaitan dengan penyakit BRD4 dan E3 Parkin ligase dan mendapati interaksi yang tidak diketahui sebelum ini.Dengan pemeriksaan overexpression, dua substrat yang tidak diketahui, Ssu72 dan SNW1, telah dikenalpasti untuk Parkin, yang degradasinya dimediasi oleh laluan ubiquitination-proteasome.
Pencirian rangkaian protein yang tepat mendasari banyak proses selular asas.Oleh itu, pemetaan spatiotemporal yang sangat tepat bagi interaksi protein akan menyediakan asas molekul untuk mentafsir laluan biologi, patologi penyakit, dan mengganggu interaksi ini untuk tujuan terapeutik.Untuk tujuan ini, kaedah yang mampu mengesan interaksi temporal dalam sel atau tisu hidup adalah sangat diingini.Spektrometri Jisim Pemurnian Perkaitan (AP-MS) telah lama digunakan untuk mengenal pasti rakan kongsi pengikat protein yang menarik (POI).Dengan pembangunan kaedah proteomik kuantitatif, Bioplex3.0 telah dicipta, pangkalan data rangkaian protein terbesar berdasarkan AP-MS.Walaupun AP-MS sangat berkuasa, langkah lisis dan pencairan sel dalam aliran kerja adalah berat sebelah ke arah interaksi pengikatan yang lemah dan sementara dan memperkenalkan artifak pasca lisis seperti pasangan interaksi palsu yang tidak mempunyai pembahagian sebelum lisis.
Untuk menangani isu ini, asid amino tidak semulajadi (UAA) dengan kumpulan silang silang dan platform pelabelan berdekatan (PL) enzimatik (cth APEX dan BioID)5 telah dibangunkan.Walaupun kaedah UAA telah berjaya digunakan dalam banyak senario dan memberikan maklumat tentang pelekat protein langsung, pengoptimuman tapak sisipan UAA masih diperlukan.Lebih penting lagi, ia ialah kaedah pelabelan stoikiometrik yang tidak mempunyai pembalikan pemangkin bagi peristiwa pelabelan.Sebaliknya, kaedah PL enzimatik, seperti kaedah BioID, menggabungkan ligase biotin kejuruteraan kepada POI7, yang kemudiannya mengaktifkan biotin untuk membentuk perantaraan ester biotinil-AMP reaktif.Enzim dengan itu memangkin dan membebaskan "awan" biotin yang diaktifkan yang melabelkan residu lisin proksimal.Walau bagaimanapun, BioID memerlukan lebih daripada 12 jam untuk mendapatkan isyarat berlabel yang mencukupi, yang menghalang penggunaannya dengan resolusi temporal.Menggunakan evolusi terarah berdasarkan paparan yis, TurboID direka berdasarkan BioID untuk menjadi lebih cekap, membolehkan pelabelan cekap dengan biotin dalam masa 10 minit, membolehkan proses yang lebih dinamik dikaji.Oleh kerana TurboID sangat aktif dan tahap biotin endogen mencukupi untuk pelabelan peringkat rendah, pelabelan latar belakang menjadi masalah yang berpotensi apabila pelabelan yang dipertingkatkan dan bermasa diperlukan dengan penambahan biotin eksogen.Di samping itu, ester yang diaktifkan adalah kurang reaktif (t1/2 ~5 min), yang boleh membawa kepada jejari pelabelan yang besar, terutamanya selepas tepu protein jiran dengan biotin 5. Dalam pendekatan lain, gabungan genetik peroksidase askorbat kejuruteraan (iaitu biotin- radikal fenol dan membenarkan pelabelan protein dalam masa satu minit9, 10. APEX digunakan secara meluas untuk mengenal pasti proteom subselular, kompleks protein membran, dan kompleks protein isyarat sitosolik11, 12. Walau bagaimanapun, keperluan untuk kepekatan tinggi peroksida boleh menjejaskan protein atau laluan redoks, mengganggu proses selular.
Oleh itu, kaedah baharu yang mampu menjana spesies penindasan jejari berlabel yang lebih reaktif dengan ketepatan spatial dan temporal yang tinggi tanpa mengganggu laluan selular dengan ketara akan menjadi tambahan penting kepada kaedah sedia ada. Di antara spesies reaktif, oksigen singlet membangkitkan perhatian kami kerana jangka hayatnya yang singkat dan jejari resapan terhad (t1/2 < 0.6 µs dalam sel)13. Di antara spesies reaktif, oksigen singlet membangkitkan perhatian kami kerana jangka hayatnya yang singkat dan jejari resapan terhad (t1/2 < 0.6 µs dalam sel)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограгнича и ограгнича и ограслород из-за его короткого времени жизни и ограгнича / 1 злодород из-за его короткого времени жизни и ограгнича/13 злодного Antara bentuk aktif, oksigen singlet menarik perhatian kami kerana hayatnya yang singkat dan jejari resapan terhad (t1/2 < 0.6 µs dalam sel)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）行走们一行中文他们有1. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 ( Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограница/0 хифкдный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограница/2хифкдн Antara bentuk aktif, oksigen singlet menarik perhatian kita kerana hayatnya yang singkat dan jejari resapan terhad (t1/2 < 0.6 μs dalam sel).Oksigen singlet telah dilaporkan mengoksidakan secara rawak metionin, tyrosine, histidine dan tryptophan, menjadikannya polar 14,15 untuk melekat pada amina atau probe berasaskan tiol16,17.Walaupun oksigen singlet telah digunakan untuk melabelkan RNA petak subselular, strategi untuk menggunakan semula penanda kedekatan POI endogen masih belum diterokai.Di sini, kami mempersembahkan platform yang dipanggil pelabelan kedekatan bergantung kepada fotoaktif (PDPL), di mana kami menggunakan cahaya biru untuk menerangi POI yang digabungkan dengan fotosensitizer miniSOG dan mencetuskan penjanaan oksigen singlet untuk mengoksidakan sisa proksimal, diikuti dengan pengubahsuaian yang mengandungi amina untuk mengoksidakan probe kimia ke dalam. sel hidup perantaraan..Kami menguji sekumpulan probe kimia untuk memaksimumkan kekhususan teg dan mengenal pasti tapak pengubahsuaian menggunakan aliran kerja proteomik terbuka.Perbandingan sebelah menyebelah PDPL dengan TurboID menunjukkan liputan proteomik PDPL yang lebih khusus dan komprehensif.Kami menggunakan pendekatan ini untuk penanda khusus organel proteom subselular dan pengenalan proteom am untuk rakan kongsi yang mengikat untuk protein pengawalseliaan epigenetik yang berkaitan dengan kanser BRD4 dan E3 ligase Parkin yang berkaitan dengan penyakit Parkinson, yang mengesahkan kedua-dua rangkaian protein yang diketahui dan tidak diketahui. interaksi..Keupayaan PDPL untuk mengenali substrat E3 dalam kompleks protein besar mewakili situasi di mana pengiktirafan pengikat tidak langsung diperlukan.Dua substrat parkin yang tidak diketahui yang dimediasi oleh ubiquitination-proteasome telah disahkan in situ.
Terapi fotodinamik (PDT)19 dan penyahaktifan laser berbantu kromofor (CALI)20, di mana penyinaran cahaya dengan fotosensitizer menjana oksigen singlet, boleh menyahaktifkan protein sasaran atau menyebabkan kematian sel.Oleh kerana oksigen singlet ialah bahan yang sangat reaktif dengan jarak resapan teori kira-kira 70 nm, pengoksidaan terhad secara ruang di sekeliling fotosensitizer boleh dikawal.Berdasarkan konsep ini, kami memutuskan untuk menggunakan oksigen singlet untuk mencapai pelabelan rapat kompleks protein dalam sel hidup.Kami telah membangunkan pendekatan kemoproteomik PDPL untuk memenuhi empat fungsi: (1) untuk memangkinkan penjanaan oksigen singlet aktif yang serupa dengan pendekatan enzimatik PL;(2) menyediakan pelabelan diselesaikan masa pada permulaan cahaya;(3) dengan pengubahan (4) Elakkan menggunakan kofaktor endogen (seperti biotin) untuk mengurangkan latar belakang, atau gunakan reagen eksogen yang sangat mengganggu (seperti peroksida) untuk meminimumkan pendedahan sel kepada tekanan persekitaran.
Pemeka foto boleh dibahagikan kepada dua kategori termasuk fluorofor berat molekul kecil (cth rose bengal, methylene blue)22 dan protein kecil yang dikodkan secara genetik (cth miniSOG, KillerRed)23.Untuk mencapai reka bentuk modular, kami membangunkan platform PDPL generasi pertama dengan menambahkan protein photosensitizer (PS) kepada POI24, 25 (Rajah 1a).Apabila disinari dengan cahaya biru, oksigen singlet mengoksidakan sisa-sisa asid amino nukleofilik proksimal, menghasilkan kekutuban umpolung yang bersifat elektrofilik dan seterusnya boleh bertindak balas dengan nukleofil kuar amina16,17.Probe direka bentuk dengan pemegang alkuna untuk membolehkan kimia klik dan tarik ke bawah untuk pencirian LC/MS/MS.
Ilustrasi skematik pelabelan kompleks protein yang dimediasi oleh miniSOG.Apabila terdedah kepada cahaya biru, sel yang mengekspresikan miniSOG-POI menjana oksigen singlet, yang mengubah suai protein berinteraksi tetapi bukan protein tidak mengikat.Hasil perantaraan fotooksidasi dipintas oleh label geganti probe kimia amina untuk membentuk tambahan kovalen.Kumpulan alkynyl pada probe kimia membenarkan kimia klik untuk pengayaan dengan tarik-turun diikuti dengan kuantiti LC-MS/MS.b Struktur kimia probe amina 1-4.c Analisis gel pendarfluor perwakilan penanda proteomik pengantara miniSOG setempat mitokondria menggunakan probe 1-4 dan kuantifikasi relatif berdasarkan kepadatanometri gel.Nisbah isyarat kepada latar belakang probe kimia dinilai menggunakan eksperimen kawalan negatif tidak termasuk cahaya biru atau menggunakan sel HEK293T tanpa ekspresi miniSOG.n = 2 sampel bebas biologi.Setiap titik mewakili replika biologi.d Pengesanan perwakilan dan kuantifikasi PDPL menggunakan probe 3 yang dioptimumkan dalam kehadiran atau ketiadaan komponen PDPL yang ditunjukkan seperti c.n = 3 sampel bebas biologi.Setiap titik mewakili replika biologi.Garis tengah dan misai mewakili min dan ± sisihan piawai.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Pengimejan konfokal bagi oksigen singlet dengan pewarnaan Si-DMA merah jauh.Bar skala: 10 µm.Pengimejan gel dan eksperimen confocal diulang secara bebas sekurang-kurangnya dua kali dengan hasil yang sama.
Kami mula-mula menguji keupayaan photosensitizers matang miniSOG26 dan KillerRed23, dinyatakan secara stabil dalam HEK293T, untuk mengantara pelabelan propargylamine proteom sebagai probe kimia (Tambahan Rajah 1a).Analisis pendarfluor gel menunjukkan bahawa pelabelan keseluruhan proteom dicapai menggunakan miniSOG dan penyinaran cahaya biru, manakala tiada produk pelabelan yang kelihatan diperhatikan dengan KillerRed.Untuk meningkatkan nisbah isyarat kepada latar belakang, kami kemudiannya menguji satu set probe kimia yang mengandungi aniline (1 dan 3), propylamine (2), atau benzylamine (4).Kami mendapati bahawa sel HEK293T sendiri mempunyai isyarat latar belakang yang lebih tinggi berbanding tanpa cahaya biru, mungkin disebabkan oleh fotosensitizer riboflavin endogen, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Probe kimia berasaskan aniline 1 dan 3 memberikan kekhususan yang lebih baik, dengan HEK293T secara stabil mengekspresikan miniSOG dalam mitokondria memaparkan peningkatan > 8 kali ganda dalam isyarat untuk probe 3, manakala probe 2 digunakan dalam kaedah pelabelan RNA CAP-seq hanya memaparkan ~2.5- peningkatan isyarat lipat, mungkin disebabkan oleh pilihan kereaktifan yang berbeza antara RNA dan protein (Rajah 1b, c). Probe kimia berasaskan aniline 1 dan 3 memberikan kekhususan yang lebih baik, dengan HEK293T secara stabil mengekspresikan miniSOG dalam mitokondria memaparkan peningkatan > 8 kali ganda dalam isyarat untuk probe 3, manakala probe 2 digunakan dalam kaedah pelabelan RNA CAP-seq hanya memaparkan ~2.5- peningkatan isyarat lipat, mungkin disebabkan oleh pilihan kereaktifan yang berbeza antara RNA dan protein (Rajah 1b, c).Probe kimia berasaskan aniline 1 dan 3 menunjukkan kekhususan yang lebih baik: HEK293T, yang secara stabil menyatakan miniSOG dalam mitokondria, menunjukkan lebih daripada peningkatan 8 kali ganda dalam isyarat untuk probe 3, manakala probe 2, digunakan dalam kaedah pelabelan RNA CAP-seq, sahaja menunjukkan ~ 2.5 kali ganda peningkatan isyarat, mungkin disebabkan oleh pilihan kereaktifan yang berbeza antara RNA dan protein (Rajah 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性,, HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 探针 探针 探针 的 的 增加 增加> 8 倍, 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性,, hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 表达 表达 探针 探针 探针 的 的 的 信号 增加 增加 增加 增加 增加 增加 而 于 标记 标记 的 的 的 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAProbe kimia berasaskan aniline 1 dan 3 mempunyai kekhususan yang lebih baik, HEK293T secara stabil menyatakan miniSOG dalam mitokondria, dan probe 3 mempunyai peningkatan lebih 8 kali ganda dalam isyarat, manakala probe 2 untuk kaedah pelabelan RNA CAP-seq menunjukkan hanya ~2.5 kali ganda peningkatan.dalam isyarat, mungkin disebabkan oleh pilihan tindak balas yang berbeza antara RNA dan protein (Rajah 1b, c).Selain itu, probe 3 isomer dan hidrazine probe (probe 5, 6, 7) telah diuji, mengesahkan pengoptimuman probe 3 (Tambahan Rajah 1b, c).Begitu juga, analisis pendarfluor dalam gel mendedahkan parameter eksperimen lain yang dioptimumkan: panjang gelombang penyinaran (460 nm), kepekatan probe kimia (1 mM), dan masa penyinaran (20 min) (Tambahan Rajah 2a–c).Meninggalkan sebarang komponen atau langkah dalam protokol PDPL mengakibatkan pembalikan isyarat yang ketara ke latar belakang (Rajah 1d).Terutamanya, pelabelan protein dikurangkan dengan ketara dengan kehadiran natrium azida atau trolox, yang diketahui dapat memadamkan oksigen singlet.Kehadiran D2O, yang diketahui menstabilkan oksigen singlet, meningkatkan isyarat pelabelan.Untuk menyiasat sumbangan spesies oksigen reaktif yang lain kepada pelabelan, manitol dan vitamin C telah ditambah untuk mewujudkan pemusnah radikal hidroksil dan superoksida, masing-masing, 18, 29, tetapi mereka tidak didapati mengurangkan pelabelan.Penambahan H2O2, tetapi bukan pencahayaan, tidak menghasilkan pelabelan (Tambahan Rajah 3a).Pengimejan oksigen singlet pendarfluor dengan probe Si-DMA mengesahkan kehadiran oksigen singlet dalam wayar HEK293T-miniSOG, tetapi tidak dalam wayar HEK293T asal.Di samping itu, mitoSOX Red tidak dapat mengesan pengeluaran superoksida selepas pencahayaan (Rajah 1e dan Rajah Tambahan 3b) 30. Data ini sangat mencadangkan bahawa oksigen singlet ialah spesies oksigen reaktif utama yang bertanggungjawab untuk pelabelan proteomik berikutnya.Sitotoksisiti PDPL dinilai termasuk penyinaran cahaya biru dan probe kimia, dan tiada sitotoksisiti ketara diperhatikan (Tambahan Rajah 4a).
Untuk mengkaji mekanisme pelabelan dan membolehkan pengenalpastian proteomik kompleks protein menggunakan LC-MS/MS, kita perlu terlebih dahulu menentukan asid amino mana yang diubah suai dan jisim delta label probe.Methionine, histidine, tryptophan dan tyrosine telah dilaporkan diubah suai oleh oksigen singlet14,15.Kami menyepadukan aliran kerja TOP-ABPP31 dengan carian terbuka tidak berat sebelah yang disediakan oleh platform pengkomputeran FragPipe berdasarkan MSFragger32.Selepas pengubahsuaian oksigen singlet dan pelabelan probe kimia, kimia klik dilakukan menggunakan label pengurangan biotin yang mengandungi penghubung boleh belah, diikuti dengan regangan neutravidin dan pencernaan trypsin.Peptida yang diubah suai, masih terikat pada resin, telah difotocleaved untuk analisis LC-MS / MS (Rajah 2a dan Data Tambahan 1).Sebilangan besar pengubahsuaian berlaku sepanjang proteom dengan lebih 50 padanan peta peptida (PSM) disenaraikan (Rajah 2b).Yang menghairankan, kami hanya memerhatikan pengubahsuaian histidin, mungkin disebabkan oleh kereaktifan histidin teroksida yang lebih tinggi terhadap probe aniline daripada asid amino lain.Menurut mekanisme pengoksidaan histidin yang diterbitkan oleh oksigen singlet,21,33 struktur jisim delta yang dicadangkan bagi +229 Da sepadan dengan penambahan probe 3 dengan 2-oxo-histidine selepas dua pengoksidaan, manakala +247 Da ialah hasil hidrolisis. daripada +229 Da (Tambahan Rajah 5).Penilaian spektrum MS2 menunjukkan kebolehpercayaan yang tinggi bagi pengenalpastian kebanyakan ion y dan b, termasuk pengenalpastian ion serpihan yang diubah suai (y dan b) (Rajah 2c).Analisis konteks bagi jujukan tempatan histidin diubah suai PDPL mendedahkan keutamaan motif sederhana untuk sisa hidrofobik kecil pada kedudukan ±1 (Tambahan Rajah 4b).Secara purata, 1.4 histidin dikenal pasti setiap protein, dan tapak penanda ini ditentukan oleh kawasan permukaan boleh diakses pelarut (SASA) dan analisis ketersediaan pelarut relatif (RSA) (Tambahan Rajah 4c, d).
Aliran kerja yang tidak berat sebelah untuk mengkaji selektiviti sisa menggunakan platform pengkomputeran FragPipe yang dikuasakan oleh MSFragger.Penyambung boleh belah digunakan dalam kimia Klik untuk membenarkan pembelahan foto peptida yang diubah suai daripada resin streptavidin.Carian terbuka telah dilancarkan untuk mengenal pasti banyak pengubahsuaian, serta sisa yang berkaitan.b Tetapkan jisim pengubahsuaian yang berlaku sepanjang proteom.Pemetaan peptida PSM.c Anotasi spektrum MS2 tapak histidin diubah suai dengan probe 3. Sebagai contoh yang mewakili, tindak balas kovalen dengan probe 3 menambah +229.0938 Da kepada asid amino yang diubah suai.d Ujian mutasi digunakan untuk menguji penanda PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) dan PRDX1 (H10A, H81A, H169A) telah ditransfeksi dengan plasmid jenis liar untuk pengesanan anti-Bendera.e Peptida sintetik telah bertindak balas dengan miniSOG yang telah dimurnikan dengan kehadiran probe 3 dan produk yang sepadan dengan Δm +247 dan +229 telah dicatatkan dalam spektrum LC-MS.f Interaksi protein-ke-protein in vitro dimodelkan dengan miniSOG-6xHis-tag dan antibodi anti-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) dan analisis Western blot anti-tikus bagi kompleks antibodi miniSOG-6xHis/anti-6xHis yang dilabelkan dengan probe 3, bergantung pada masa pendedahan kepada cahaya.Label untuk protein individu dinyatakan dalam berat molekul yang sepadan: rantai ringan antibodi LC, rantai berat antibodi HC.Eksperimen ini diulang secara bebas sekurang-kurangnya dua kali dengan keputusan yang sama.
Untuk pengesahan biokimia tapak pelabelan, PRDX3 dan PRDX1 yang dikenal pasti oleh spektrometri jisim telah ditukar daripada histidin kepada alanin dan dibandingkan dengan jenis liar dalam ujian transfeksi.Keputusan PDPL menunjukkan bahawa mutasi telah mengurangkan pelabelan dengan ketara (Rajah 2d).Sementara itu, jujukan peptida yang dikenal pasti dalam carian terbuka telah disintesis dan bertindak balas secara in vitro dengan miniSOG yang telah dimurnikan dengan kehadiran probe 3 dan cahaya biru, menghasilkan produk dengan anjakan jisim +247 dan +229 Da apabila dikesan oleh LC-MS (Rajah). 2e).).Untuk menguji sama ada protein proksimal yang berinteraksi boleh dilabelkan secara in vitro sebagai tindak balas kepada pengaktifan foto miniSOG, kami mereka bentuk ujian kedekatan buatan dengan interaksi antara protein miniSOG-6xHis dan antibodi monoklonal anti-His in vitro (Rajah 2f).Dalam ujian ini, kami menjangkakan pelabelan proksimal bagi rantai berat dan ringan antibodi dengan miniSOG.Malah, anti-tikus (mengiktiraf rantai berat dan ringan antibodi berlabel anti-6xHis) dan streptavidin Western blots menunjukkan biotinilasi kuat bagi rantai berat dan ringan.Terutama, kami melihat autobiotinilasi miniSOG disebabkan oleh tag 6xHis dan pautan silang antara rantai ringan dan berat, yang mungkin berkaitan dengan jurang yang diterangkan sebelum ini antara lisin dan tindak balas proksimal 2-oxo-histidine.Sebagai kesimpulan, kami menyimpulkan bahawa PDPL mengubah suai histidine dengan cara yang bergantung kepada jarak.
Matlamat seterusnya kami adalah untuk mencirikan proteom subselular untuk menguji kekhususan pelabelan in situ.Oleh itu, kami secara stabil menyatakan miniSOG dalam nukleus, matriks mitokondria, atau membran ER luar sel HEK293T (Rajah 3a).Analisis pendarfluor gel mendedahkan jalur berlabel yang banyak di tiga lokasi subselular serta corak pelabelan yang berbeza (Rajah 3b).Analisis pengimejan pendarfluor menunjukkan kekhususan tinggi PDPL (Rajah 3c).Aliran kerja PDPL diikuti dengan tindak balas klik dengan pewarna rhodamine untuk menggambarkan proteom subselular menggunakan mikroskop pendarfluor, dan isyarat PDPL dikolokalisasikan dengan DAPI, penjejak mitokondria, atau penjejak ER, mengesahkan kesetiaan tinggi PDPL.Bagi tiga lokasi organel, perbandingan sebelah menyebelah PDPL dengan TurboID menggunakan avidin western blot menunjukkan bahawa PDPL dilabelkan dengan lebih khusus berbanding dengan kawalan masing-masing.Di bawah keadaan PDPL, lebih banyak jalur berlabel muncul, menunjukkan lebih banyak protein berlabel PDPL (Tambahan Rajah 6a-d).
Perwakilan skematik pelabelan protein khusus organel pengantara miniSOG.miniSOG menyasarkan matriks mitokondria melalui pelakuran kepada N-terminal 23 asid amino COX4 manusia (mito-miniSOG), nukleus melalui pelakuran kepada H2B (nukleus-miniSOG), dan Sec61β melalui bahagian sitoplasma membran ER (ER-miniSOG). ).Petunjuk termasuk pengimejan gel, pengimejan confocal, dan spektrometri jisim.b Imej gel perwakilan tiga profil PDPL khusus organel.CBB Coomassie Biru Cemerlang.c Perwakilan imej confocal sel HEK293T secara stabil mengekspresikan miniSOG dengan penyetempatan subselular berbeza yang dikesan oleh antibodi berlabel V5 (merah).Penanda subselular digunakan untuk mitokondria dan ER (hijau).Aliran kerja PDPL termasuk pengesanan proteom subselular berlabel miniSOG (kuning) menggunakan kimia klik Cy3-azide.Bar skala: 10 µm.d Plot gunung berapi proteom bertanda PDPL dalam pelbagai organel yang dikira mengikut kuantifikasi tidak berlabel (n = 3 eksperimen biologi bebas).Ujian-t Pelajar dua ekor digunakan pada plot gunung berapi.Jenis liar HEK293T digunakan sebagai kawalan negatif. Protein yang berubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan> perbezaan keamatan ion 2 kali ganda). Protein yang berubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan> perbezaan keamatan ion 2 kali ganda). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protein yang diubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan > perbezaan 2 kali ganda dalam keamatan ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protein yang diubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan > perbezaan 2 kali ganda dalam kekuatan ion).Protein berkaitan penting untuk HEK293T-miniSOG tetapi tidak penting untuk HEK293T ditunjukkan dalam warna hijau.e Analisis kekhususan set data proteomik daripada eksperimen d.Jumlah bilangan protein yang signifikan secara statistik dalam setiap organel (titik merah dan hijau) ditandakan di bahagian atas.Histogram menunjukkan protein setempat dalam organel berdasarkan MitoCarta 3.0, analisis GO dan A. Ting et al.orang ramai.Set data berasingan untuk mitokondria, nukleus dan ER.Eksperimen ini diulang secara bebas sekurang-kurangnya dua kali dengan keputusan yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Digalakkan oleh keputusan gel dan pengimejan, kuantifikasi bebas label digunakan untuk mengukur proteom yang dikenal pasti dalam setiap organel (Data Tambahan 2).HEK293T yang tidak ditransmisikan digunakan sebagai kawalan negatif untuk menolak penanda latar belakang. Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein yang diperkaya dengan ketara (p <0.05 dan > 2 kali ganda keamatan ion) serta protein tunggal yang hanya terdapat dalam garis pengekspres miniSOG (Rajah 3d titik merah dan hijau). Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein yang diperkaya dengan ketara (p <0.05 dan > 2 kali ganda keamatan ion) serta protein tunggal yang hanya terdapat dalam garis pengekspres miniSOG (Rajah 3d titik merah dan hijau). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analisis plot gunung berapi menunjukkan protein diperkaya dengan ketara (p<0.05 dan > 2 kali ganda keamatan ion) serta protein tunggal yang hanya terdapat dalam garisan pengekspres miniSOG (Rajah 3d, titik merah dan hijau).火山图 分析 显示 出 显着 富集 富集 的 蛋白质 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 在于 表达 表达 系 中 的 单一 单一 蛋白质 (图 3d 红色 和 绿色点)。火山图 分析 显示 出 显着 的 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 仅 存 在于 在于 在于 表达 表达 系 的 的 单一 蛋白质 (图 3d 红色 绿色点 。。。)))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analisis plot gunung berapi mendedahkan protein diperkaya dengan ketara (p<0.05 dan > 2x kekuatan ionik) serta protein tunggal hanya terdapat dalam garis ekspresi miniSOG (titik merah dan hijau dalam Rajah 3d).Menggabungkan data ini, kami mengenal pasti 1364, 461, dan 911 protein membran luar nuklear, mitokondria, dan ER yang signifikan secara statistik.Untuk menganalisis ketepatan PDPL setempat organelle, kami menggunakan analisis MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) dan A. Ting et al.set data8 digunakan untuk mitokondria, nukleus, dan ER untuk menguji kekhususan organel bagi protein yang dikesan, sepadan dengan ketepatan 73.4, 78.5, dan 73.0% (Rajah 3e).Kekhususan PDPL mengesahkan bahawa PDPL ialah alat yang ideal untuk mengenal pasti proteom khusus organel.Terutama, analisis subochondrial protein mitokondria yang dikenal pasti menunjukkan bahawa proteom yang terperangkap terutamanya diedarkan dalam matriks dan membran dalam (masing-masing 226 dan 106), menyumbang 91.7% (362) daripada jumlah protein mitokondria yang dikenal pasti.tahap PDPL yang tinggi juga disahkan (Tambahan Rajah 7a).Begitu juga, analisis subnuklear menunjukkan bahawa proteom yang ditangkap sebahagian besarnya diedarkan dalam nukleus, nukleoplasma dan nukleolus (Tambahan Rajah 7b).Analisis proteomik nuklear dengan peptida isyarat penyetempatan nuklear (3xNLS) menunjukkan ketepatan yang sama dengan konstruk H2B (Tambahan Rajah 7c–h).Untuk menentukan kekhususan penanda PDPL, laminin A nuklear dipilih sebagai perangkap POI7 yang lebih diskret setempat.PDPL mengenal pasti 36 protein yang diperkaya dengan ketara, di mana 12 protein (30.0% termasuk lamin A) adalah protein berinteraksi lamin A yang dicirikan dengan baik yang dijelaskan oleh pangkalan data String, dengan peratusan yang lebih tinggi daripada kaedah BioID (122 protein) 28 daripada 28. , 22.9 %) 7. Kaedah kami mengenal pasti lebih sedikit protein, mungkin disebabkan oleh kawasan pelabelan yang terhad, yang dimungkinkan oleh oksigen singlet yang lebih aktif.Analisis GO menunjukkan bahawa protein yang dikenal pasti kebanyakannya terletak di nukleoplasma (26), membran nuklear (10), membran nuklear (9), dan liang nuklear (5).Secara kolektif, protein setempat nuklear ini menyumbang 80% daripada protein yang diperkaya, seterusnya menunjukkan kekhususan PDPL (Tambahan Rajah 8a–d).
Setelah mewujudkan keupayaan PDPL untuk melakukan penandaan kedekatan dalam organel, kami kemudiannya menguji sama ada PDPL boleh digunakan untuk menganalisis rakan kongsi POI yang mengikat.Khususnya, kami berusaha untuk menentukan analisis PDPL protein sitosolik, yang dianggap sebagai sasaran yang lebih sukar daripada rakan sejawatan membran mereka kerana sifatnya yang sangat dinamik.Protein bromodomain dan extraterminal (BET) BRD4 telah menarik perhatian kami kerana peranan utamanya dalam pelbagai penyakit 35, 36 .Kompleks yang dibentuk oleh BRD4 adalah coactivator transkrip dan sasaran terapeutik yang penting.Dengan mengawal selia ekspresi faktor transkripsi c-myc dan Wnt5a, BRD4 dianggap sebagai penentu utama leukemia myeloid akut (AML), pelbagai myeloma, limfoma Burkitt, kanser kolon dan penyakit radang37,38.Selain itu, sesetengah virus menyasarkan BRD4 untuk mengawal selia transkripsi virus dan selular, seperti papillomavirus, HIV dan SARS-CoV-236,39.
Untuk memetakan interaksi BRD4 menggunakan PDPL, kami menggabungkan miniSOG dengan isoform N- atau C-terminal pendek BRD4.Keputusan proteomik mendedahkan tahap pertindihan yang tinggi antara kedua-dua binaan (Tambahan Rajah 9a).Proteom nuklear yang dikenal pasti dengan miniSOG-H2B meliputi 77.6% daripada protein yang berinteraksi dengan BRD4 (Tambahan Rajah 9b).Kemudian, masa pencahayaan yang berbeza (2, 5, 10, 20 min) digunakan untuk melaraskan jejari penanda (Rajah 4a dan data tambahan 3).Kami menyimpulkan bahawa pada tempoh foto yang lebih pendek, PDPL terutamanya akan melabelkan rakan pengikat langsung, manakala tempoh yang lebih lama akan merangkumi protein yang dikenal pasti semasa tempoh pengaktifan foto yang lebih pendek serta sasaran tidak langsung dalam kompleks pelabelan.Malah, kami mendapati pertindihan yang kuat antara titik masa bersebelahan (84.6% untuk 2 dan 5 min; 87.7% untuk 5 dan 10 min; 98.7% untuk 10 dan 20 min) (Rajah 4b dan Rajah Tambahan 9c).Dalam semua kumpulan eksperimen, kami mendapati bukan sahaja pelabelan diri BRD4, tetapi beberapa sasaran yang diketahui seperti MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A dan HMGB1 beranotasi dalam pangkalan data rentetan.Kekuatan ionik sasaran ini adalah berkadar dengan masa pendedahan (Rajah 4c dan Rajah Tambahan 9d).Analisis GO protein yang dikenal pasti dalam kumpulan 2 minit menunjukkan bahawa protein yang dikenal pasti disetempat dalam nukleus dan terlibat dalam pembentukan semula kromatin dan fungsi polimerase RNA.Fungsi molekul protein diperkaya dalam pengikatan kromatin atau pengaktifan transkrip, selaras dengan fungsi BRD4 (Rajah 4d).Analisis interaksi protein yang didayakan pangkalan data rentetan mendedahkan tahap pertama interaksi tidak langsung antara BRD4 dan kompleks interaksi keluarga HDAC seperti SIN3A, NCOR2, BCOR, dan SAP130 (Rajah 4e dan Rajah Tambahan 9e), selaras dengan histon asetilasi yang mengikat BRD4 dan HDAC ..Di samping itu, sasaran wakil yang dikenal pasti oleh LC-MS/MS, termasuk Sin3A, NSUN2, Fus dan SFPQ, telah disahkan oleh Western blotting (Rajah 4f).Baru-baru ini, isoform pendek BRD4 telah dilaporkan membentuk nukleus dengan sifat pemisahan fasa cecair-cecair (LLPS).Protein pengikat RNA Fus dan SFPQ mengantara LLPS pelbagai proses selular dan telah dikenal pasti di sini sebagai protein pengikat BRD4 yang tidak direkodkan.Interaksi antara BRD4 dan SFPQ telah disahkan oleh eksperimen co-imunoprecipitation (co-IP) (Rajah 4g), mencadangkan satu lagi mekanisme untuk pemisahan fasa cecair-cecair pengantara BRD4 yang layak untuk siasatan lanjut.Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa PDPL ialah platform yang ideal untuk mengenal pasti BRD4 yang berinteraksi serta protein pengikat yang tidak diketahui.
Perwakilan skematik penanda kedekatan BRD4 pengantara miniSOG, masa pendedahan: 2, 5, 10, dan 20 min.b Pertindihan protein yang dikenal pasti pada masa pencahayaan yang berbeza.Pengayaan protein yang dikenal pasti dalam HEK293T-miniSOG-BRD4 adalah signifikan secara statistik berbanding HEK293T jenis liar.c Keamatan ion apabila mengira wakil tidak berlabel protein pengikat BRD4 yang diketahui semasa masa pendedahan yang ditentukan.n = 3 sampel bebas biologi.Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai.d Analisis ontologi gen (GO) protein yang dikenal pasti dalam kumpulan 2 minit.Sepuluh istilah GO pertama disenaraikan.Buih diwarnakan mengikut kategori istilah GO, dan saiz gelembung adalah berkadar dengan bilangan protein yang ditemui dalam setiap istilah.e Analisis rentetan protein yang berinteraksi dengan BRD4.Bulatan kuning adalah gam langsung dan bulatan kelabu adalah lapisan pertama gam tidak langsung.Garis merah mewakili interaksi yang ditentukan secara eksperimen dan garis biru mewakili interaksi yang diramalkan.f Sasaran pengikatan BRD4 wakil yang dikenal pasti dalam LC-MS/MS telah disahkan oleh penghapusan Barat.g Eksperimen co-imunopresipitasi mengesahkan interaksi antara SFPQ dan BRD4.Eksperimen ini diulang secara bebas sekurang-kurangnya dua kali dengan keputusan yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Di samping mengenal pasti sasaran berkaitan POI yang tidak berdaftar, kami membuat hipotesis bahawa PDPL akan sesuai untuk mengenal pasti substrat untuk enzim, yang memerlukan pencirian protein pengikat tidak langsung dalam kompleks besar untuk menganotasi substrat tidak berdaftar.Parkin (dikodkan oleh PARK2) ialah ligase E3 dan mutasi dalam parkin diketahui menyebabkan penyakit Parkinson juvana autosomal resesif (AR-JP)42.Di samping itu, parkin telah digambarkan sebagai penting untuk mitophagy (mitochondrial autophagy) dan penyingkiran spesies oksigen reaktif.Walau bagaimanapun, walaupun beberapa substrat parkin telah dikenal pasti, peranan parkin dalam penyakit ini masih tidak jelas.Untuk menganotasi substratnya yang tidak dicirikan, PDPL telah diuji dengan menambahkan miniSOG pada terminal N- atau C-parkin.Sel telah dirawat dengan pengangkut proton karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone (CCCP) untuk mengaktifkan parkin melalui laluan PINK1-Parkin.Berbanding dengan keputusan BRD4 PDPL kami, gabungan N-terminus parkin mendedahkan set protein sasaran yang lebih besar, walaupun ia meliputi sebahagian besar terminal C (177 daripada 210) (Rajah 5a, b dan Data Tambahan 4).hasilnya konsisten dengan laporan bahawa teg terminal-N boleh mengaktifkan Parkin44 secara menyimpang.Yang menghairankan, terdapat hanya 18 protein bertindih dalam data kami dengan hasil AP-MS yang diterbitkan untuk Parkin43, mungkin disebabkan oleh perbezaan antara garisan sel dan aliran kerja proteomik.Sebagai tambahan kepada empat protein yang diketahui (ARDM1, HSPA8, PSMD14, dan PSMC3) yang dikenal pasti melalui dua kaedah (Rajah 5c)43.Untuk mengesahkan lagi keputusan LC-MS/MS, rawatan PDPL dan pembongkaran Barat seterusnya digunakan untuk membandingkan keputusan ujian sel induk HEK293T dan garisan parkin terminal N yang stabil.Sasaran yang tidak diketahui sebelum ini CDK2, DUT, CTBP1, dan PSMC4 telah diuji dengan pengikat yang diketahui, DNAJB1 (Rajah 5d).
Plot gunung berapi protein berinteraksi parkin dalam sel HEK293T dengan miniSOG yang dinyatakan secara stabil bersatu dengan terminal N- atau C parkin (n = 3 eksperimen biologi bebas).Ujian-t Pelajar dua ekor digunakan pada plot gunung berapi.HEK293T digunakan sebagai kawalan negatif. Protein yang berubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan> perbezaan keamatan ion 2 kali ganda). Protein yang berubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan> perbezaan keamatan ion 2 kali ganda). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protein yang diubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan > perbezaan 2 kali ganda dalam keamatan ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protein yang diubah dengan ketara diserlahkan dalam warna merah (p <0.05 dan > perbezaan 2 kali ganda dalam kekuatan ion).Protein berkaitan penting untuk HEK293T-miniSOG tetapi tidak penting untuk HEK293T ditunjukkan dalam warna hijau.b Gambar rajah Venn menunjukkan pertindihan protein antara binaan N-terminal dan C-terminal.Teg N-terminal boleh mengaktifkan parkin secara menyimpang dan menghasilkan protein yang lebih dikenali.c Gambar rajah Venn menunjukkan pertindihan protein antara PDPL dan AP-MS.Interaktor terkenal disenaraikan, termasuk 4 daripada 18 protein bertindih dan 11 daripada 159 protein yang dikenal pasti secara khusus dalam PDPL.d Sasaran wakil yang dikenal pasti oleh LC-MS/MS telah disahkan oleh Western blotting.e Ssu72 dan SNW1 telah dikenal pasti sebagai substrat parkin tidak berdaftar.Plasmid protein bertanda FLAG ini telah dipindahkan ke HEK293T dan HEK293T-Parkin-miniSOG diikuti oleh rawatan CCCP pada pelbagai titik masa.Kemerosotan lebih ketara dalam garis ekspresi berlebihan Parkin.f Menggunakan perencat proteasome MG132, telah disahkan bahawa proses degradasi Ssu72 dan SNW1 dimediasi oleh proteasome-ubiquitination.Eksperimen ini diulang secara bebas sekurang-kurangnya dua kali dengan keputusan yang sama.Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.
Terutama, protein yang dikenal pasti oleh PDPL mesti termasuk protein pengikat parkin dan substratnya.Untuk mengesan substrat parkin yang tidak berdaftar, kami memilih tujuh protein yang dikenal pasti (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 dan SNW1) dan plasmid yang ditransfeksi untuk mendedahkan gen ini kepada HEK293T biasa dan secara stabil mengekspresikan rawatan HEK293T miniSOG-Parkin diikuti dengan rawatan CCCP.Tahap protein Ssu72 dan SNW1 telah dikurangkan dengan ketara dalam garis miniSOG-Parkin yang stabil (Rajah 5e).Rawatan dengan CCCP selama 12 jam mengakibatkan kemerosotan yang paling ketara bagi kedua-dua substrat.Untuk menyiasat sama ada degradasi Ssu72 dan SNW1 dikawal oleh proteasome-ubiquitination, perencat proteasome MG132 telah ditambah untuk menghalang aktiviti proteasome, dan sebenarnya kami mendapati bahawa proses degradasi mereka telah dihalang (Rajah 5f).Sasaran bukan substrat tambahan telah disahkan sebagai interaksi Parkin menggunakan Western blotting (Tambahan Rajah 10), yang menunjukkan hasil yang konsisten dengan LC-MS/MS.Kesimpulannya, penyepaduan aliran kerja PDPL dengan pengesahan transfeksi protein sasaran membolehkan pengenalpastian substrat ligase E3 yang tidak berdaftar.
Kami telah membangunkan platform penandaan kedekatan biasa yang membolehkan anda mengenal pasti POI yang berinteraksi dalam ruang dan masa.Platform ini berasaskan protein fotosensitizer miniSOG, iaitu hanya kira-kira 12 kDa, kurang daripada separuh saiz enzim APEX2 matang (27 kDa) dan satu pertiga saiz TurboID (35 kDa).Saiz yang lebih kecil sepatutnya meluaskan julat aplikasi untuk mengkaji interaksi protein kecil.Penerokaan lanjut bagi fotosensitizer tambahan, sama ada protein yang dikodkan secara genetik atau molekul kecil, diperlukan untuk meningkatkan hasil kuantum oksigen singlet dan mengembangkan kepekaan pendekatan ini.Untuk versi semasa miniSOG, resolusi temporal yang tinggi boleh dicapai menggunakan pencahayaan biru untuk mengaktifkan penanda kedekatan.Di samping itu, masa pendedahan yang lebih lama mengeluarkan "awan" oksigen singlet yang lebih besar, mengakibatkan pengubahsuaian lebih banyak sisa histidin distal, jejari pelabelan meningkat dan keupayaan untuk memperhalusi resolusi spatial PDPL.Kami juga menguji tujuh probe kimia untuk meningkatkan nisbah isyarat kepada latar belakang dan meneroka mekanisme molekul di sebalik pendekatan ini.Aliran kerja TOP-ABPP digabungkan dengan carian terbuka yang tidak berat sebelah mengesahkan bahawa pengubahsuaian berlaku hanya dalam histidin dan tiada persekitaran mikro yang konsisten diperhatikan untuk peningkatan pengubahsuaian histidin, kecuali untuk keutamaan sederhana untuk histidin dalam rantau gelung.
PDPL juga telah digunakan untuk mencirikan proteom subselular dengan kekhususan dan liputan proteom sekurang-kurangnya setanding dengan pelabelan kedekatan lain dan kaedah siasatan kimia khusus organel.Penanda kedekatan juga telah berjaya digunakan untuk mencirikan permukaan, lisosom, dan proteom yang berkaitan dengan rahsia46,47.Kami percaya bahawa PDPL akan serasi dengan organel subselular ini.Di samping itu, kami mencabar PDPL dengan mengenal pasti sasaran untuk pengikatan protein sitosolik yang lebih kompleks daripada protein terikat membran kerana sifat dinamiknya dan penglibatan dalam interaksi yang lebih temporal.PDPL telah digunakan untuk dua protein, coactivator transkrip BRD4 dan ligase E3 Parkin yang berkaitan dengan penyakit.Kedua-dua protein ini dipilih bukan sahaja untuk fungsi biologi asas mereka, tetapi juga untuk kaitan klinikal dan potensi terapeutik mereka.Bagi kedua-dua POI ini, rakan kongsi yang terkenal serta sasaran yang tidak berdaftar telah dikenal pasti.Terutama, protein SFPQ yang berkaitan dengan pemisahan fasa telah disahkan oleh co-IP, yang mungkin menunjukkan mekanisme baharu yang mana BRD4 (isoform pendek) mengawal LLPS.Pada masa yang sama, kami percaya bahawa pengenalpastian substrat Parkin adalah senario di mana pengenalpastian pelekat tidak langsung diperlukan.Kami mengenal pasti dua substrat parkin yang tidak dikenali dan mengesahkan kemerosotannya di sepanjang laluan ubiquitination-proteasome.Baru-baru ini, strategi perangkap berasaskan mekanisme telah dibangunkan untuk mengesan substrat hidrolase dengan memerangkapnya dengan enzim.Walaupun ini adalah kaedah yang sangat berkuasa, ia tidak sesuai untuk analisis substrat yang terlibat dalam pembentukan kompleks besar dan memerlukan pembentukan ikatan kovalen antara enzim dan substrat.Kami menjangkakan bahawa PDPL boleh diperluaskan untuk mengkaji kompleks protein dan keluarga enzim lain, seperti keluarga deubiquitinase dan metalloprotease.
Bentuk baharu miniSOG, dipanggil SOPP3, telah dibangunkan dengan pengeluaran oksigen singlet yang dipertingkatkan.Kami membandingkan miniSOG dengan SOPP3 dan mendapati prestasi penandaan yang lebih baik, walaupun nisbah isyarat-ke-bunyi kekal tidak berubah (Tambahan Rajah 11).Kami membuat hipotesis bahawa pengoptimuman SOPP3 (cth, melalui evolusi terarah) akan membawa kepada protein fotosensitizer yang lebih cekap yang memerlukan masa cahaya yang lebih pendek dan dengan itu membolehkan proses selular yang lebih dinamik ditangkap.Terutama, versi semasa PDPL terhad kepada persekitaran selular kerana ia memerlukan pencahayaan cahaya biru dan tidak boleh menembusi tisu dalam.Ciri ini menghalang penggunaannya dalam kajian model haiwan.Walau bagaimanapun, gabungan optogenetik dengan PDPL boleh memberi peluang untuk penyelidikan haiwan, terutamanya dalam otak.Di samping itu, fotosensitizer inframerah kejuruteraan lain juga mengalih keluar had ini.Penyelidikan sedang dijalankan dalam bidang ini.
Talian sel HEK293T diperoleh daripada ATCC (CRL-3216).Talian sel diuji negatif untuk jangkitan mycoplasma dan dibiakkan dalam DMEM (Thermo, #C11995500BT) ditambah dengan 10% serum lembu janin (FBS, Vistech, #SE100-B) dan 1% penisilin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).dibesarkan di.
3-Aminophenylene (sampel 3) dan (4-ethynylphenyl)methanamine (sampel 4) telah dibeli daripada Bidepharm.Propylamine (probe 2) telah dibeli daripada Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) telah disintesis mengikut kaedah yang diterbitkan.
Jadual Tambahan 1 menyenaraikan binaan genetik yang digunakan dalam kajian ini.Jujukan miniSOG dan KillerRed telah diklon daripada plasmid hadiah daripada P. Zou (Universiti Peking).Urutan penyasaran matriks mitokondria diperoleh daripada 23 asid amino terminal N COX4 dan diklonkan ke dalam vektor yang ditunjukkan menggunakan pemasangan Gibson (Beyotime, #D7010S).Untuk menyasarkan membran dan nukleus retikulum endoplasma, DNA manusia SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) yang dikuatkan oleh PCR daripada perpustakaan cDNA sel HEK293T dan DNA H2B (didermakan oleh D. Lin, Makmal Teluk Shenzhen) dan diklon , seperti yang dinyatakan di atas.Melainkan dinyatakan sebaliknya, gen protein lain yang digunakan untuk pemindahan dan pembinaan garisan sel yang stabil telah dikuatkan PCR daripada perpustakaan cDNA sel HEK293T.G3S (GGGS) dan G4S (GGGGS) digunakan sebagai penghubung antara protein umpan dan miniSOG.Teg epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) telah ditambahkan pada binaan gabungan ini.Untuk ekspresi dalam mamalia dan untuk mewujudkan garisan sel yang stabil, binaan gabungan miniSOG telah disubklonkan ke dalam vektor lentiviral pLX304.Untuk ekspresi bakteria, miniSOG telah diklon ke dalam vektor pET21a berlabel 6xHis di terminal C.
Sel HEK293T telah disemai pada 2.0 x 105 sel setiap telaga dalam plat enam telaga dan ditransfeksi 24 jam kemudian dengan plasmid lentiviral rekombinan (2.4 μg pLX304) dan plasmid pembungkusan virus (1.5 μg psPAX2 dan 1.2 μg pMD2.G00) , #C0533), kira-kira 80% gabungan.Selepas pemindahan semalaman, medium ditukar dan diinkubasi selama 24 jam lagi.Pengumpulan virus itu dilakukan selepas 24, 48 dan 72 jam.Sebelum jangkitan pada garisan sel sasaran, medium virus telah ditapis melalui penapis 0.8 μm (Merck, #millex-GP) dan polybrene (Solarbio, #H8761) telah ditambah kepada kepekatan 8 μg/ml.Selepas 24 jam, sel dibenarkan pulih dengan menukar medium.Sel telah dipilih menggunakan 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) untuk tiga petikan pertama sebagai pemilihan ketat yang lebih rendah.Kemudian menggunakan 20 μg/ml sebagai rejimen yang lebih ketat untuk tiga laluan seterusnya.
Sel telah disemai dalam ruang 12-telaga (Ibidi, #81201) pada ketumpatan kira-kira 20,000 sel setiap telaga.Untuk menambah baik lekatan sel HEK293T, tambahkan 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) yang dicairkan dalam salin buffer fosfat (PBS, Sangon, #B640435) pada 37°C.Bilik-bilik tersebut telah dirawat terlebih dahulu selama 1 jam dan kemudian dikeluarkan dengan PBS.Selepas 24 jam, sel dibasuh sekali dengan PBS, diinkubasi dengan 1 mM probe 3 dalam larutan garam seimbang Hanks segar (HBSS, Gibco, #14025092) selama 1 jam pada 37 ° C, dan kemudian diinkubasi dengan LED biru (460 nm ).) telah disinari selama 10 minit pada suhu bilik.Selepas itu, sel-sel telah dibasuh dua kali dengan PBS dan diperbaiki dengan 4% formaldehid dalam PBS (Sangon, #E672002) selama 15 minit pada suhu bilik.Lebihan formaldehid dikeluarkan daripada sel tetap dengan mencuci tiga kali dengan PBS.Sel kemudiannya dipermeabilkan dengan 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) dalam PBS dan dibasuh 3 kali dengan PBS.Kemudian keluarkan ruang dan tambahkan pada setiap sampel 25 µl campuran tindak balas klik yang mengandungi 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) dan 0.5 mg/ml natrium askorbat (Aladdin, no. S105024) dan diinkubasi selama 30 minit pada suhu bilik.Selepas tindak balas snap, sel telah dibasuh enam kali dengan PBS yang mengandungi 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) dan kemudian disekat dengan 5% BSA (Abcone, #B24726) dalam PBST selama 30 minit pada suhu bilik.
Untuk imunostaining kolokalisasi, sel diinkubasi dengan antibodi utama mengikut keadaan yang ditunjukkan: tetikus anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), arnab anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), antibodi anti-kalneksin poliklonal arnab (1:500, Abcam, #ab22595) atau antibodi monoklonal A/C anti-lamin arnab (1:500; CST, #2032) pada 4 °C semalaman.Selepas mencuci 3 kali dengan PBST, sel telah diinkubasi dengan antibodi sekunder: kambing anti-arnab Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dicairkan 1:1000, kambing anti-tikus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) dicairkan 1:1000.pencairan Cairkan pada suhu bilik selama 30 minit.Sel kemudiannya dibasuh 3 kali dengan PBST dan diwarnakan dengan DAPI (Thermo, #D1306) dalam PBS selama 10 minit pada suhu bilik.Selepas 3 cucian dengan PBS, sel telah dimeterai dalam 50% gliserol (Sangon, #A600232) dalam PBS untuk pengimejan.Imej imunofluoresen diperoleh menggunakan mikroskop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 dan perisian ZNE 3.5.
Untuk pengimejan pendarfluor oksigen singlet, sel telah dibasuh dua kali dengan penimbal Hanks HEPES sebelum menambah 100 nM Si-DMA dalam penimbal HEPES Hanks (DOJINDO, #MT05).Selepas terdedah kepada cahaya, sel-sel tersebut diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37°C selama 45 minit.Sel-sel kemudiannya dibasuh dua kali dengan penimbal HEPES Hanks dan diwarnakan balas dengan Hoechst dalam penimbal HEPES Hanks selama 10 minit pada suhu bilik dan divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal ZEISS LSM 900., #M36008) dalam penimbal HBSS yang mengandungi kalsium dan magnesium.Selepas pendedahan kepada cahaya atau doxorubicin (MCE, #HY-15142A), sel diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37° C. selama 10 minit, dibasuh dua kali dengan penimbal HBSS, dan diinkubasi dengan Hoechst dalam penimbal HBSS pada suhu bilik.minit.Doxorubicin digunakan sebagai kawalan probe positif di mana sel dirawat dengan 20 μM doxorubicin dalam HBSS yang mengandungi 1% BSA selama 30 minit.Imej imunofluoresen diperoleh menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 900.
Sel HEK293T yang mengekspresikan mito-miniSOG secara stabil telah disemai pada ketumpatan kira-kira 30% dalam hidangan 15 cm.Selepas 48 jam, apabila ~ 80% pertemuan dicapai, sel-sel telah dibasuh sekali dengan PBS, diinkubasi dengan 1 mM Probe 3 dalam penimbal HBSS segar dalam selama 1 jam pada 37 ° C dan kemudian diterangi dengan LED biru selama 10 minit di dalam bilik. suhu..Selepas itu, sel-sel itu dibasuh dua kali dengan PBS, dikikis dan digantung semula dalam penimbal PBS sejuk ais yang mengandungi perencat protease bebas EDTA (MCE, #HY-K0011).Sel-sel telah dilisekan dengan menyonikasikan hujung selama 1 minit (1 saat dan 1 saat pada amplitud 35%).Campuran yang dihasilkan telah disentrifugasi pada 15, 871 xg selama 10 minit pada 4 ° C untuk membuang serpihan, dan kepekatan supernatan diselaraskan kepada 4 mg / mL menggunakan kit ujian protein BCA (Beyotime, #P0009).Campurkan 1 ml lysate di atas dengan 0.1 mM biotin azide fotodegradasi (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), ligan TBTA 0.1 mM (Aladdin, #T162437), dan 1 mM CuSO4 inkubator putaran ke atas selama 1 jam pada suhu bilik.Selepas tindak balas mengejut, tambahkan campuran ke dalam larutan pra-campuran (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) dalam botol kaca 10 ml.Sampel dicampur dan diempar pada 4500 g selama 10 minit pada suhu bilik.Larutan bawah dan atas dibuang, mendakan dibasuh dua kali dengan 1 ml metanol dan disentrifugasi pada 15871×g selama 5 minit pada 4°C.Tambah 1 ml 8 M urea (Aladdin, no. U111902) dalam 25 mM ammonium bikarbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) untuk melarutkan mendakan.Sampel telah disusun semula dengan 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 dalam 25 mM ABC) selama 40 minit pada 55°C diikuti dengan penambahan 15 mM iodoacetamide segar (Sangon, #A600539) pada suhu bilik dalam gelap.Alkilasi dalam masa 30 minit..Tambahan 5 mM dithiothreitol telah ditambah untuk menghentikan tindak balas.Sediakan kira-kira 100 µl NeutrAvidin agarose manik (Thermo, #29202) untuk setiap sampel dengan mencuci 3 kali dengan 1 ml PBS.Larutan proteom di atas dicairkan dengan 5 ml PBS dan diinkubasi dengan manik agarose NeutrAvidin yang telah dibasuh selama 4 jam pada suhu bilik.Manik kemudiannya dibasuh 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandungi 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandungi 1M urea, dan 3 kali dengan 5 ml ddH2O.Manik-manik itu kemudiannya dituai dengan sentrifugasi dan digantung semula dalam 200 μl 25 mM ABC yang mengandungi 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) dan 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize semalaman pada 37°C dengan putaran.Tindak balas dihentikan dengan menambahkan asid formik (Thermo, # A117-50) sehingga pH mencapai 2-3.Manik dicuci 3 kali dengan 1 ml PBS yang mengandungi 0.2% SDS, 3 kali dengan 1 ml PBS yang mengandungi 1 M urea, dan kemudian 3 kali dengan 1 ml air suling.Peptida yang diubah suai dikeluarkan oleh lisis cahaya (365 nm) selama 90 minit menggunakan 200 μl 70% MeOH.Selepas sentrifugasi, supernatan dikumpulkan.Manik kemudian dibasuh sekali dengan 100 μl 70% MeOH dan supernatan dikumpulkan.Sampel telah dikeringkan dalam penumpu vakum Speedvac dan disimpan pada -20°C sehingga analisis.
Untuk mengenal pasti dan mengira peptida diubah suai oksigen singlet, sampel telah dilarutkan semula dalam 0.1% asid formik dan 1 μg peptida dianalisis menggunakan spektrometer jisim Orbitrap Fusion Lumos Tribrid yang dilengkapi dengan sumber ESI nano daripada Tune dan Xcalibur daripada perisian vendor 4.3.Sampel dipisahkan pada lajur kapilari bersaiz 75 µm × 15 cm yang dibungkus secara dalaman dengan bahan C18 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) dan disambungkan kepada sistem EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptida dipisahkan dengan kromatografi kecerunan 95 minit linear daripada 8% pelarut B kepada 50% pelarut B (A = 0.1% asid formik dalam air, B = 0.1% asid formik dalam 80% asetonitril), kemudian meningkat secara linear kepada 98% B min. dalam 6 min pada kadar aliran 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos mengumpul data secara berselang-seli antara imbasan MS penuh dan imbasan MS2 bergantung pada data.Voltan sputtering ditetapkan kepada 2.1 kV dan suhu kapilari pengangkutan ion ialah 320°C.Spektrum MS (350-2000 m/z) dikumpul dengan resolusi 120,000, AGC 4 × 105, dan masa input maksimum 150 ms.10 pendahulu bercas darab yang paling biasa dalam setiap imbasan penuh telah dipecahkan menggunakan HCD dengan tenaga perlanggaran normal sebanyak 30%, tetingkap pengasingan empat kali ganda 1.6 m/z, dan tetapan resolusi 30,000.Sasaran AGC untuk spektrometri jisim tandem menggunakan 5×104 dan masa input maksimum 150 ms.Pengecualian dinamik ditetapkan kepada 30 saat. Ion yang tidak ditetapkan atau yang mempunyai caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS. Ion yang tidak ditetapkan atau yang mempunyai caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ dan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion atau ion yang tidak ditetapkan dengan caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ dan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion atau ion yang tidak ditentukan dengan caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS.
Data mentah diproses menggunakan platform pengkomputeran FragPipe berdasarkan MSFragger.Pincang jisim dan asid amino yang sepadan ditentukan menggunakan algoritma carian terbuka dengan toleransi jisim prekursor -150 hingga 500 Da.Peptida yang diubah suai kemudiannya dikenal pasti menggunakan pengubahsuaian histidin dengan keuntungan jisim +229.0964 dan +247.1069 Da dalam PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Sel-sel yang secara stabil mengekspresikan gen miniSOG yang bersatu telah disalut dalam hidangan 6 cm.Apabila mencapai ~ 80% pertemuan, sel dibasuh sekali dengan HBSS (Gibco, #14025092), kemudian diinkubasi dengan probe kimia dalam HBSS selama 1 jam pada 37 ° C dan diterangi dengan cahaya biru.LED 10W selama 20 minit pada suhu bilik.Untuk menentukan jenis spesies oksigen reaktif yang terlibat dalam PDPL, 0.5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 telah ditambah kepada sel sebagai makanan tambahan.Selepas mencuci dengan PBS sejuk, sel-sel dikikis, dikumpulkan dalam tiub emparan 1.5 ml, dan disonikasi dengan hujung selama 1 minit dalam 200 μl PBS dengan perencat protease 1x tanpa EDTA (1 s dan 1 s tanpa, amplitud 35%).Campuran yang dihasilkan telah disentrifugasi pada 15, 871 × g selama 10 minit pada 4 ° C dan kepekatan supernatan diselaraskan kepada 1 mg / mL menggunakan kit ujian protein BCA.Kira-kira 50 µl lisat di atas diinkubasi dengan 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, dan 1 mM CuSO4 selama 1 jam pada suhu bilik dengan putaran dari bawah ke atas.Selepas tindak balas klik, pemendakan dengan aseton dilakukan dengan menambahkan 250 μl aseton pra-sejuk kepada sampel, mengeram pada -20°C selama 20 minit dan mengempar pada 6010×g selama 10 minit pada 4°C.Kumpulkan pelet dan rebus dalam 50 µl 1x penimbal Laemmli selama 10 minit pada 95 °C.Sampel kemudian dianalisis pada gel panjang SDS-PAGE dan divisualisasikan menggunakan sistem pengimejan Bio-rad ChemiDoc MP Touch dengan perisian Image Lab Touch.
Ekspresi dan penulenan protein miniSOG-6xHis rekombinan telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini.Secara ringkas, sel E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) telah diubah dengan pET21a-miniSOG-6xHis dan ekspresi protein diinduksi dengan 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Selepas lisis sel, protein disucikan menggunakan manik agarose Ni-NTA (MCE, no. 70666), didialisis terhadap PBS, dan disimpan pada -80°C.
Untuk ujian kedekatan label in vitro berasaskan antibodi, campurkan 100 μM miniSOG yang telah dimurnikan, 1 mM probe 3, dan 1 μg anti-label antibodi monoklonal tetikus (TransGen, #HT501-01) dalam PBS kepada jumlah jumlah tindak balas sebanyak 50 μl..Campuran tindak balas telah disinari dengan lampu LED biru selama 0, 2, 5, 10, dan 20 minit pada suhu bilik.Campuran diinkubasi dengan 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, dan 1 mM CuSO4 selama 1 jam pada suhu bilik pada penggoncang gerakan ke atas.Selepas tindak balas sekejap, tambah 4x penimbal Laemmli terus ke dalam adunan dan rebus pada 95°C selama 10 minit.Sampel dianalisis pada gel SDS-PAGE dan dianalisis dengan pembongkaran barat dengan streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Peptida sintetik yang mengandungi histidine dengan amidasi terminal C (LHDALDAK-CONH2) digunakan untuk menganalisis pelabelan in vitro berasaskan peptida berdekatan.Dalam ujian ini, 100 μM miniSOG yang dimurnikan, 10 mM probe 3 dan 2 μg/ml peptida sintetik dicampur dalam PBS dalam jumlah jumlah tindak balas 50 μl.Campuran tindak balas telah disinari dengan lampu LED biru selama 1 jam pada suhu bilik.Satu mikroliter sampel dianalisis menggunakan sistem LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spektrometer jisim dengan perisian analisis spektrum MassLynx).
Sel HEK293T yang secara stabil mengekspresikan gen gabungan miniSOG telah disemai dalam hidangan 10 cm untuk garisan dengan penyetempatan organel yang berbeza (Mito, ER, Nukleus) dan hidangan 15 cm untuk garis Parkin-miniSOG dan BRD4-miniSOG.Apabila mencapai ~ 90% pertemuan, sel-sel telah dibasuh sekali dengan HBSS, kemudian diinkubasi dengan probe 3 dalam HBSS selama 1 jam pada 37 ° C dan diterangi dengan LED biru 10 W pada suhu bilik.Untuk pelabelan bukan sentuhan Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) dengan probe 3 dalam HBSS telah ditambah selama 1 jam pada 37°C.Langkah-langkah lisis sel, kimia klik, pengurangan dan alkilasi adalah sama seperti yang diterangkan di atas, kecuali 2 mg lisat ditambah dan biotin PEG3 azida digunakan dalam tindak balas klik dan bukannya biotin azida yang boleh terurai.Selepas pengayaan, manik dicuci 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandungi 0.2% SDS, 3 kali dengan 5 ml PBS yang mengandungi 1 M urea, dan 3 kali dengan 5 ml PBS.Selepas itu, 2 µg trypsin ditambah kepada 300 µl 25 mM ABC yang mengandungi 1 M urea untuk membelah protein semalaman pada suhu 37°C.Tindak balas dihentikan dengan menambahkan asid formik sehingga pH 2-3 dicapai.Selepas trypsinization pada manik, larutan peptida dinyahgaram menggunakan lajur SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) dan dikeringkan dalam penumpu vakum Speedvac.Peptida telah dilarutkan semula dalam 0.1% asid formik dan 500 ng peptida dianalisis menggunakan spektrometer jisim Orbitrap Fusion Lumos Tribrid yang dilengkapi dengan sumber nano-ESI yang diterangkan di atas.Peptida diasingkan pada pralajur RP-HPLC komersial (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) dan lajur RP-HPLC analitik (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), kedua-duanya diisi dengan 2 μm.kecerunan daripada 8% kepada 35% ACN dalam 60 minit, kemudian secara linear meningkat kepada 98% B dalam 6 minit pada kadar aliran 300 Nl/min.Spektrum MS (350-1500 m/z) dikumpul dengan resolusi 60,000, AGC 4 × 105, dan masa input maksimum 50 ms.Ion terpilih dipecah secara berurutan oleh HCD dalam kitaran 3 s dengan tenaga perlanggaran normal sebanyak 30%, tetingkap pengasingan empat kali ganda 1.6 m/z, dan resolusi 15000. Sasaran AGC spektrometer jisim tandem 5 × 104 dan masa suntikan maksimum sebanyak 22 ms telah digunakan.Pengecualian dinamik ditetapkan kepada 45 saat. Ion yang tidak ditetapkan atau yang mempunyai caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS. Ion yang tidak ditetapkan atau yang mempunyai caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ dan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion atau ion yang tidak ditetapkan dengan caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ dan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion atau ion yang tidak ditentukan dengan caj 1+ dan >7+ telah ditolak untuk MS/MS.
Langkah penyediaan sampel sehingga pengayaan manik NeutrAvidin adalah sama seperti dalam analisis LC-MS/MS yang diterangkan di atas.Kira-kira 50 μg lysate digunakan sebagai input untuk kawalan pemuatan dan 2 mg lysate digunakan untuk tindak balas klik.Selepas pengayaan dan pencucian dengan neutravidin, protein terikat telah dielusikan dengan menambahkan 50 μl penimbal Laemmli ke dalam manik resin agarose dan mendidih pada 95° C. selama 5 minit.Input beban kawalan dan sampel yang diperkayakan manik dianalisis oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) dengan kaedah Western blot standard.Membran telah disekat dengan susu skim 5% (Sangon, #A600669) dalam TBS yang mengandungi 0.1% tween-20 (TBST) dan diinkubasi secara berurutan dengan antibodi primer dan sekunder.Antibodi utama telah dicairkan 1:1000 dalam susu skim 5% dalam TBST dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C.Antibodi sekunder digunakan dalam nisbah 1:5000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik.Membran telah divisualisasikan oleh chemiluminescence menggunakan sistem pengimejan Chemidoc MP.Semua imbasan tompok dan gel yang tidak dipotong dalam rajah ditunjukkan sebagai data mentah.
Antibodi utama yang digunakan dalam kajian ini termasuk antibodi monoklonal anti-SFPQ arnab (CST, no. 71992), antibodi monoklonal anti-FUS arnab (CST, no. 67840), antibodi poliklonal anti-NSUN2 arnab (Proteintech, no. 20854-1- AP), antibodi poliklonal anti-mSin3A arnab (Abcam, #ab3479), antibodi monoklonal anti-tag tetikus (TransGen, #HT201-02), antibodi monoklonal anti-β-actin tetikus (TransGen, #HC201-01), anti arnab -CDK2 antibodi monoklonal (ABklonal, #A0094), antibodi monoklonal arnab kepada CTBP1 (ABklonal, #A11600), antibodi poliklonal arnab kepada DUT (ABklonal, #A2901), antibodi poliklonal arnab kepada PSMC4 (ABklonal, #A2505), arnab anti- Antibodi poliklonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Antibodi ini digunakan pada pencairan 1:1000 dalam susu skim 5% dalam TBST.Antibodi sekunder yang digunakan dalam kajian ini termasuk IgG anti-arnab (TransGen, #HS101-01), IgG anti-tikus (TransGen, #HS201-01) pada pencairan 1:5000.
Untuk menyiasat lebih lanjut sama ada BRD4 berinteraksi dengan SFPQ, sel HEK293T dan BRD4-miniSOG yang stabil yang mengekspresikan HEK293T telah disalut dalam hidangan 10 cm.Sel-sel telah dibasuh dengan PBS sejuk dan dilisekan dalam penimbal lisis Pierce IP 1 ml (Thermo Fisher, #87787) dengan perencat protease bebas EDTA selama 30 minit pada suhu 4°C.Selepas itu, lisat dikumpulkan dalam tiub emparan 1.5 ml dan disentrifugasi pada 15,871 xg selama 10 minit pada 4 ° C.Supernatan telah dituai dan diinkubasi dengan 5 µg anti-V5 antibodi monoklonal tikus berlabel (CST, #80076) semalaman pada suhu 4°C.Basuh lebih kurang 50 µl manik magnet A/G protein (MCE, #HY-K0202) dua kali dengan PBS yang mengandungi 0.5% Tween-20.Kemudian lisat sel diinkubasi dengan manik magnet selama 4 jam pada suhu 4°C dengan putaran dari bawah ke atas.Kemudian manik dicuci empat kali dengan 1 ml penimbal PBST dan direbus pada suhu 95°C selama 5 minit.Sampel dianalisis pada gel SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF menggunakan kaedah Western blot standard.Membran telah disekat dalam susu skim 5% dalam TBST dan diinkubasi secara berurutan dengan antibodi primer dan sekunder.Antibodi Utama Arnab anti-SFPQ antibodi monoklonal (CST, #71992) digunakan pada nisbah 1:1000 dalam susu skim 5% dalam TBST dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C.IgG anti-arnab digunakan pada nisbah 1:5000 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik.Membran telah divisualisasikan oleh chemiluminescence menggunakan sistem pengimejan Chemidoc MP.
Semua struktur yang digunakan untuk analisis Kawasan Permukaan Boleh Dicapai Pelarut (SASA) diperoleh daripada Bank Data Protein (PDB)52 atau Pangkalan Data Struktur Protein AlphaFold53.SASA mutlak dikira untuk setiap sisa menggunakan program FreeSASA.Hanya data SASA yang lengkap dan tidak jelas untuk histidine berlabel dan jirannya digunakan untuk mendapatkan min SASA bagi setiap struktur.Kebolehcapaian pelarut relatif (RSA) untuk setiap histidin dikira dengan membahagikan nilai SASA mutlak dengan luas permukaan sisa maksimum empirikal yang tersedia untuk pelarut.Semua histidin kemudiannya diklasifikasikan sebagai tersembunyi jika purata RSA adalah di bawah 20%, jika tidak terdedah56.
Fail mentah yang diperoleh dalam mod DDA telah dicari menggunakan Proteome Discoverer (v2.5) atau MSfragger (Fragpipe v15.0) dalam pangkalan data protein disahkan SwissProt yang sesuai yang mengandungi bahan cemar biasa.Peptida memerlukan trypsin lengkap dengan dua tapak belahan yang hilang, metilasi karbamoil sebagai pengubahsuaian tetap dan pengoksidaan metionin sebagai pengubahsuaian dinamik.Toleransi berat prekursor dan serpihan ditetapkan masing-masing kepada 10 ppm dan 0.02 Da (MS2 Orbitrap). Hit bahan cemar telah dikeluarkan, dan protein ditapis untuk mendapatkan kadar penemuan palsu <1%. Hit bahan cemar telah dikeluarkan, dan protein ditapis untuk mendapatkan kadar penemuan palsu <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного 1%. Kesan bahan cemar telah dikeluarkan dan protein ditapis untuk memberikan kadar pengesanan palsu <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружены. Hit bahan cemar telah dikeluarkan dan protein ditapis untuk mencapai kadar positif palsu <1%.Untuk analisis kuantitatif tanpa menggunakan label, kandungan protein ternormal daripada tiga ulangan biologi digunakan.Analisis penyetempatan subselular protein dilakukan menggunakan analisis Gene Ontology (GO) daripada DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 dan pangkalan data yang disusun dan diterbitkan oleh kumpulan Alice Ting.Peta gunung berapi diperoleh daripada Perseus (v1.6.15.0). Perubahan lipatan kelimpahan protein telah diuji untuk kepentingan statistik menggunakan ujian-t dua sisi, dan hits protein dikenal pasti dengan perubahan kelimpahan>2 (kecuali dinyatakan sebaliknya) dan nilai p <0.05. Perubahan lipatan kelimpahan protein telah diuji untuk kepentingan statistik menggunakan ujian-t dua sisi, dan hits protein dikenal pasti dengan perubahan kelimpahan>2 (kecuali dinyatakan sebaliknya) dan nilai p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Perubahan lipatan kandungan protein telah diuji untuk kepentingan statistik menggunakan ujian-t dua ekor, dan padanan protein dikenal pasti dengan perubahan kandungan >2 (kecuali dinyatakan sebaliknya) dan nilai ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (除非 另 另 有) 和 p 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Kepentingan statistik perubahan lipatan dalam kandungan protein telah diuji menggunakan ujian-t dua ekor, dan padanan protein ditentukan untuk perubahan kandungan>2 (kecuali dinyatakan sebaliknya) dan nilai-p <0.05.Analisis interaksi protein dilakukan menggunakan analisis GO bersama dengan pangkalan data String.
Tiga replika biologi telah dijalankan dengan keputusan yang sama.Analisis statistik telah dilakukan dengan GraphPad Prism (perisian GraphPad) dan plot gunung berapi dijana dengan Perseus (v1.6.15.0).Untuk membandingkan kedua-dua kumpulan, nilai-p ditentukan menggunakan ujian-t Pelajar dua hujung.Hanya protein tunggal yang dikenal pasti sekurang-kurangnya dua kali dalam kumpulan eksperimen dimasukkan ke dalam plot gunung berapi, dan nilai yang hilang yang sepadan dalam kumpulan kawalan digantikan dengan Perseus daripada taburan normal supaya nilai p dapat dikira.Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.Dalam analisis proteomik untuk analisis statistik, banyak protein yang muncul dalam sekurang-kurangnya dua replika biologi dikekalkan.Kaedah statistik tidak digunakan untuk pra-menentukan saiz sampel.Percubaan tidak rawak.Para penyelidik tidak buta terhadap tugas semasa eksperimen dan penilaian keputusan.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak Laporan Penyelidikan Alam yang dipautkan kepada artikel ini.
Data spektrometri jisim yang diperoleh dalam kajian ini telah diserahkan kepada Konsortium ProteomeXchange melalui repositori rakan kongsi iProX57 di bawah set data ID PXD034811 (set data PDPL-MS).Data mentah disediakan dalam bentuk fail data mentah.Artikel ini menyediakan data asal.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Mengenali kawasan kejiranan: menggunakan biotinilasi bergantung kepada jarak untuk mencirikan kompleks protein dan memetakan organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Mengenali kawasan kejiranan: menggunakan biotinilasi bergantung kepada jarak untuk mencirikan kompleks protein dan memetakan organel.Gingras, AS, Abe, KT dan Raut, B. Kebiasaan dengan persekitaran: menggunakan biotinilasi bergantung kedekatan untuk mencirikan kompleks protein dan memetakan organel. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并细。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Memahami kejiranan: gunakan pergantungan kejiranan terhadap kehidupan biologi.Gingras, AS, Abe, KT dan Raut, B. Memahami kedekatan: pencirian kompleks protein dan pemetaan organel menggunakan biotinilasi bergantung kepada kedekatan.semasa.Pendapat saya.bahan kimia.biologi 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Memetakan persekitaran mikro dengan memindahkan tenaga Dexter ke sel imun.Sains 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Rangkaian skala dua protein mengesan pembentukan semula khusus sel bagi interaksi manusia.Sel 184, 3022–3040.e3028 (2021).