Berita

Strategi diagnostik tradisional untuk mengesan penyakit berjangkit memerlukan penggunaan instrumen atas bangku yang tidak sesuai untuk ujian tempat penjagaan (POCT).Mikrobendalir baru muncul ialah teknologi yang sangat kecil, automatik dan bersepadu yang merupakan alternatif yang berpotensi kepada kaedah tradisional untuk diagnostik di tapak yang cepat, kos rendah dan tepat.Kaedah diagnostik molekul digunakan secara meluas dalam peranti mikrofluid sebagai kaedah paling berkesan untuk pengesanan patogen.Kajian ini meringkaskan kemajuan terkini dalam diagnostik molekul berasaskan mikrobendalir penyakit berjangkit dari kedua-dua perspektif akademik dan perindustrian.Pertama, kami menerangkan pemprosesan biasa pada cip asid nukleik, termasuk prarawatan sampel, penguatan dan bacaan isyarat.Ciri-ciri, kebaikan dan keburukan empat jenis platform mikrobendalir kemudiannya dibandingkan.Seterusnya, kita akan membincangkan penggunaan ujian digital untuk kuantifikasi mutlak asid nukleik.Kedua-dua peranti diagnostik molekul berasaskan mikrofluid komersil klasik dan terkini diringkaskan sebagai bukti keadaan semasa pasaran.Akhir sekali, kami mencadangkan arahan masa depan untuk diagnosis mikrofluidik penyakit berjangkit.
Penyakit berjangkit disebabkan oleh patogen, termasuk bakteria, virus, dan parasit, yang tersebar di seluruh dunia.Tidak seperti penyakit lain, patogen cepat dijangkiti dan merebak antara manusia dan haiwan perumah melalui inokulasi, udara dan media air [1].Pencegahan penyakit berjangkit adalah kritikal sebagai langkah kesihatan awam.Tiga strategi utama untuk memerangi penyakit berjangkit: (1) mengawal sumber jangkitan;(2) gangguan laluan penghantaran;(3) perlindungan populasi yang terdedah.Antara strategi utama, kawalan sumber jangkitan dianggap sebagai strategi paling penting kerana kemudahan dan kos yang rendah.Diagnosis pantas, pengasingan, dan rawatan individu yang dijangkiti adalah kritikal, memerlukan strategi diagnostik yang cepat, sensitif dan tepat [2].Diagnosis semasa penyakit berjangkit biasanya menggabungkan pemeriksaan klinikal berdasarkan tanda dan gejala dan kajian makmal seperti kultur sel dan diagnostik molekul, yang memerlukan kakitangan terlatih, prosedur intensif buruh, dan peralatan ujian yang mahal [3, 4].Pencegahan wabak penyakit berjangkit memerlukan diagnosis tempatan yang cepat, murah dan tepat, terutamanya di kawasan terhad sumber di mana penyakit berjangkit adalah biasa dan teruk [5], serta rawatan di padang gurun atau di medan perang, di mana kecemasan tidak dapat diramalkan..rawatan perubatan adalah terhad [6].Dalam konteks ini, mikrobendalir ialah teknologi yang menggabungkan teknologi sistem mikroelektromekanikal, nanoteknologi atau sains bahan untuk manipulasi cecair yang tepat [7,8,9,10], menyediakan kemungkinan baharu untuk pengesanan titik penjagaan (POCT).) agen berjangkit di luar hospital dan makmal.Berbanding dengan diagnostik tradisional yang memakan masa, teknologi mikrofluidik menawarkan penjimatan sampel dan kos untuk diagnostik molekul semasa wabak penyakit.Penyebaran global penyakit coronavirus 2019 (COVID-19) disebabkan oleh sindrom pernafasan akut teruk coronavirus 2 (SARS-CoV-2), jadi kepentingan mikrobendalir untuk pencegahan dan kawalan wabak yang tepat pada masanya ditekankan sekali lagi [11, 12]. , 13].Tidak seperti diagnostik tradisional, POCT mikrobendalir menggunakan peranti mudah alih kecil dari penganalisis atas bangku kepada jalur ujian aliran sisi kecil untuk menguji berhampiran titik pensampelan [14].Ujian ini menampilkan penyediaan sampel yang mudah atau tiada, penguatan isyarat pantas dan bacaan isyarat sensitif yang menghasilkan tempoh yang singkat dan keputusan yang tepat dalam beberapa minit.Ketersediaan dan pengeluaran besar-besaran instrumen penjagaan kesihatan berasaskan mikrobendalir telah mengembangkan aplikasi diagnostik langsung yang menjimatkan kos dan langsung di luar hospital, berhampiran pesakit, malah di rumah.
Antara strategi sedia ada untuk mendiagnosis penyakit berjangkit, diagnostik molekul adalah salah satu yang paling sensitif [15, 16].Di samping itu, diagnostik molekul sering digunakan sebagai piawaian emas untuk pengesanan berterusan COVID-19, membolehkan pengesanan terus kawasan spesifik virus RNA atau DNA sebelum permulaan tindak balas imun [17, 18].Dalam semakan semasa, kami membentangkan kemajuan terkini dalam proses diagnostik molekul berasaskan mikrobendalir untuk penyakit berjangkit, daripada perspektif akademik kepada perspektif industri masa hadapan (Rajah 1).Kami akan bermula dengan tiga langkah utama dalam pengesanan asid nukleik: prarawatan sampel pada cip, penguatan asid nukleik dan bacaan isyarat.Kami kemudian membandingkan pelbagai jenis platform mikrobendalir dengan struktur dan fungsinya, menunjukkan ciri unik (kekuatan dan kelemahan).Pengesanan asid nukleik digital dibincangkan dan diberikan sebagai contoh teknologi generasi ketiga untuk kuantifikasi mutlak molekul patogen berjangkit.Di samping itu, beberapa peranti POCT komersial biasa dan terkini akan dipersembahkan untuk menunjukkan keadaan semasa pasaran POCT mikrobendalir untuk diagnostik molekul.Kami juga akan membincangkan dan menerangkan visi kami untuk aplikasi masa hadapan.
Modul cip mikrobendalir untuk pengesanan asid nukleik boleh dibahagikan kepada tiga kategori (pensampelan, pengecaman, dan isyarat) mengikut fungsinya [19].Di antara modul ini, modul pensampelan terutamanya merealisasikan lisis sampel dan pengekstrakan asid nukleik.Modul sensor terutamanya mengawal penukaran dan penguatan isyarat asid nukleik.Modul isyarat mengesan isyarat yang ditukar dan diproses oleh modul penderiaan.Berdasarkan proses pengesanan asid nukleik pada cip, kami akan meringkaskan pelbagai cip yang boleh merealisasikan fungsi "input dan output".
Langkah pertama dalam pengesanan asid nukleik ialah pengekstrakan asid nukleik, iaitu mengasingkan asid nukleik sasaran daripada sampel asal.Pengekstrakan asid nukleik dilakukan untuk membersihkan asid nukleik daripada bahan cemar molekul lain, memastikan integriti struktur utama molekul asid nukleik, dan mengoptimumkan hasil.Pengekstrakan asid nukleik memerlukan lisis sampel yang diperlukan dan penangkapan asid nukleik, kualiti dan kecekapan yang mempunyai kesan yang besar terhadap hasil penyelidikan dan diagnostik.Sebarang kesan sampingan yang halus semasa pengekstrakan mungkin mengehadkan pengesanan selanjutnya.Sebagai contoh, kaedah tindak balas rantai polimerase (PCR) dan penguatan isoterma gelung (LAMP) dihalang oleh beberapa pelarut organik sisa seperti etanol dan isopropanol dalam reagen pengasingan asid nukleik [20].Pengekstrakan cecair-cecair dan pengekstrakan fasa pepejal adalah kaedah yang paling popular untuk mengasingkan asid nukleik [21], walau bagaimanapun, pengekstrakan cecair-cecair pada cip adalah amat terhad, kerana reagen yang digunakan dalam pengekstrakan cecair-cecair menyebabkan kakisan kebanyakan cip mikrobendalir. .Di sini, kami menyerlahkan kaedah pengekstrakan fasa pepejal berasaskan microarray dan membandingkan kelebihan dan kekurangannya.
Silikon adalah bahan substrat yang serasi dengan asid nukleik kerana biokompatibiliti, kestabilan, dan kemudahan pengubahsuaian [22].Yang penting, apabila diubah suai dengan silika atau bahan lain, komposit ini mempamerkan sifat untuk menjerap asid nukleik bercas negatif di bawah pH rendah, keadaan garam tinggi sambil mengelusi dengan pH tinggi, larutan garam rendah.Berdasarkan fenomena ini, adalah mungkin untuk membersihkan asid nukleik.
Pelbagai bentuk bahan berasaskan silika telah digunakan untuk pengekstrakan asid nukleik dalam mikrobendalir, seperti manik silika, serbuk, penapis mikrofiber, dan membran silika [23, 24, 25, 26].Bergantung pada sifat bahan, bahan berasaskan silikon boleh digunakan dalam litar mikro dengan cara yang berbeza.Sebagai contoh, butiran silika, serbuk, dan penapis nano komersial hanya boleh diletakkan ke dalam liang atau saluran mikro cip mikrobendalir dan membantu mengekstrak asid nukleik daripada sampel [27, 28, 29].Membran silika yang diubah suai permukaan juga boleh digunakan untuk membersihkan DNA dengan pantas daripada patogen pada kos yang rendah.Sebagai contoh, Wang et al.[30] Dengan menggabungkan tindak balas penguatan denaturasi dengan pertukaran rantai pengantara vesikel dengan membran silika yang disalut dengan oligosakarida kitosan, sistem mudah alih serba boleh telah diperkenalkan yang berjaya mengesan 102–108 unit pembentuk koloni.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., dan kehadiran virus itu mudah dilihat.Powell et al.[31] Microarrays berasaskan silikon kemudiannya digunakan untuk mengesan virus hepatitis C (HCV), virus immunodeficiency manusia (HIV), virus Zika, dan virus papilloma manusia dan pembiakan automatik, di mana mikroreaktor berliku-liku 1.3 μl telah dibangunkan untuk menangkap virus RNA.dan melakukan penguatan in situ.Sebagai tambahan kepada kaedah ini, lajur mikro silika yang diubah suai permukaan juga memainkan peranan penting dalam pengekstrakan asid nukleik, kerana geometri dan sifat bahan pengubahsuaian sangat meningkatkan kecekapan pengekstrakan.Chen et al.[32] mencadangkan platform mikrofluid untuk pengasingan RNA kepekatan rendah berdasarkan lajur mikro silikon bersalut amino.Peranti mikrobendalir ini menyepadukan tatasusunan mikropillar 0.25 cm2 pada substrat silikon untuk mencapai kecekapan pengekstrakan yang lebih tinggi melalui reka bentuk nisbah luas permukaan kepada isipadu yang tinggi.Kelebihan reka bentuk ini ialah peranti mikrobendalir boleh mencapai sehingga 95% kecekapan pengekstrakan asid nukleik.Strategi berasaskan silikon ini menunjukkan nilai mengasingkan asid nukleik dengan cepat pada kos yang rendah.Dalam kombinasi dengan cip mikrofluid, strategi pengekstrakan berasaskan silikon bukan sahaja dapat meningkatkan kecekapan pengesanan asid nukleik, tetapi juga memudahkan pengecilan dan penyepaduan peranti analisis [20].
Kaedah pengasingan magnet menggunakan zarah magnet untuk mengasingkan asid nukleik dengan kehadiran medan magnet luar.Zarah magnet yang biasa digunakan termasuk zarah magnet Fe3O4 atau γ-Fe2O3 yang disalut dengan silika, amino dan karboksil [33,34,35,36].Ciri membezakan zarah magnet berbanding kaedah SPE berasaskan silikon ialah kemudahan manipulasi dan kawalan dengan magnet luar.
Menggunakan interaksi elektrostatik antara asid nukleik dan silika, dalam keadaan garam tinggi dan pH rendah, asid nukleik diserap pada permukaan zarah magnet bersalut silika, manakala dalam keadaan garam rendah dan pH tinggi, molekul boleh dicuci. sekali lagi..Manik magnet bersalut silika memungkinkan untuk mengekstrak DNA daripada sampel volum besar (400 μL) menggunakan gerakan terkawal magnet [37].Sebagai demonstrasi, Rodriguez-Mateos et al.[38] menggunakan magnet boleh tala untuk mengawal pemindahan manik magnet ke ruang yang berbeza.Berdasarkan zarah magnet bersalut silika, 470 salinan/mL RNA genomik SARS-CoV-2 boleh diekstrak daripada sampel air sisa untuk pengesanan transkripsi terbalik LAMP (RT-LAMP) dan tindak balas boleh dibaca dalam masa 1 jam.mata kasar (Gamb. 2a).
Peranti berasaskan bahan magnet dan berliang.Gambar rajah konsep peranti mikrofluid IFAST RT-LAMP untuk pengesanan RNA SARS-CoV-2 (diadaptasi daripada [38]).b Peranti mikro emparan untuk dSPE asid nukleik swab buccal (diadaptasi daripada [39]).c Penumpu sampel berkuasa sendiri terbina dalam menggunakan kad FTA® (diadaptasi daripada [50]).d Kertas turas Fusion 5 diubah suai dengan kitosan (diadaptasi daripada [51]).SARS-CoV-2 sindrom pernafasan akut teruk coronavirus 2, gelung transkripsi terbalik RT-LAMP penguatan isoterma pengantara, rakan kongsi teknologi pencari FTA, asid nukleik NA
Zarah magnet bercas positif sesuai untuk melekatkan tulang belakang fosfat asid nukleik.Pada kepekatan garam tertentu, kumpulan fosfat bercas negatif asid nukleik boleh dicas positif pada permukaan zarah komposit magnetik.Oleh itu, nanopartikel magnetik dengan permukaan kasar dan ketumpatan tinggi kumpulan amino telah dibangunkan untuk pengekstrakan asid nukleik.Selepas pemisahan dan penyekatan magnet, nanopartikel magnetik dan kompleks DNA boleh digunakan secara langsung dalam PCR, yang menghapuskan keperluan untuk operasi pembersihan dan elusi yang kompleks dan memakan masa [35].Nanopartikel magnetik yang disalut dengan kumpulan karboksil negatif juga telah digunakan untuk memisahkan asid nukleik yang terjerap pada permukaan dalam larutan polietilena glikol dan natrium klorida berkepekatan tinggi [36].Dengan manik magnet yang diubah suai permukaan ini, pengekstrakan DNA serasi dengan penguatan seterusnya.Dignan et al.[39] menerangkan platform mikrobendalir emparan automatik dan mudah alih untuk prarawatan asid nukleik, membenarkan kakitangan bukan teknikal menggunakannya di tapak.Di samping itu, keserasian DNA terpencil dengan LAMP, kaedah yang sesuai untuk analisis asid nukleik titik penjagaan, seterusnya menunjukkan keperluan peralatan minimum dan kesesuaian untuk ujian kolorimetrik (Rajah 2b).
Kaedah manik magnet menawarkan kemungkinan pengekstrakan automatik, beberapa daripadanya wujud dalam pengekstrak asid nukleik automatik komersial [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, China) dan Biomek®;Beckman (Miami, Amerika Syarikat).), Florida, Amerika Syarikat)].Kelebihan menggabungkan manik magnet dengan mikrobendalir boleh digunakan untuk pengekstrakan automatik asid nukleik yang cekap, yang berpotensi memajukan pembangunan diagnostik molekul;bagaimanapun, gabungan manik magnetik dengan mikrobendalir masih banyak bergantung pada sistem kawalan yang kompleks untuk manipulasi tepat manik magnet, yang menjelaskan populariti produk komersil yang besar dan mahal, yang mengehadkan penggunaan selanjutnya manik magnet dalam POCT.
Beberapa bahan berliang seperti penapis nitroselulosa yang diubah suai, kad Finders Technology Associates (FTA), kertas penapis berasaskan polyethersulfone, dan bahan bersalut glycan juga telah digunakan untuk pengesanan asid nukleik [40, 41, 42, 43, 44].Bahan gentian berliang seperti kertas gentian mula-mula digunakan untuk mengasingkan DNA dengan menjerat molekul DNA terkandas panjang secara fizikal dengan gentian.Liang-liang kecil membawa kepada sekatan fizikal molekul DNA yang kuat, yang memberi kesan positif kepada pengekstrakan DNA.Oleh kerana saiz liang kertas berserabut yang berbeza, kecekapan pengekstrakan tidak dapat memenuhi keperluan penguatan DNA [45, 46].Kad FTA ialah kertas penapis komersial yang digunakan dalam bidang perubatan forensik dan digunakan secara meluas dalam bidang diagnostik molekul yang lain.Melalui penggunaan kertas penapis selulosa yang diresapi dengan pelbagai bahan kimia untuk melisiskan membran sel dalam sampel, DNA yang dibebaskan dilindungi daripada degradasi sehingga 2 tahun.Baru-baru ini, kertas selulosa yang diresapi telah dibangunkan untuk pengesanan molekul pelbagai patogen, termasuk SARS-CoV-2, leishmaniasis, dan malaria [47,48,49].HIV dalam plasma terpencil dilisiskan terus, dan asid nukleik virus diperkaya dalam membran aliran FTA® yang dibina ke dalam penumpu, yang membolehkan pengeluaran asid nukleik yang cekap [50] (Rajah 2c).Masalah utama pengesanan asid nukleik menggunakan kad FTA ialah bahan kimia seperti guanidine dan isopropanol menghalang tindak balas penguatan seterusnya.Untuk menyelesaikan masalah ini, kami membangunkan kertas penapis diubah suai kitosan Fusion 5, yang menggabungkan kelebihan kedua-dua jalinan fizikal molekul DNA dan kertas penapis berserabut, dan penjerapan elektrostatik DNA pada sebatian diubah suai kitosan untuk mencapai pengekstrakan asid nukleik yang sangat cekap. ..gentian penapis [51] (Gamb. 2d).Begitu juga, Zhu et al.[52] menunjukkan kaedah PCR diubah suai kitosan berdasarkan sistem mikrofluidik kapilari in situ untuk pengasingan pantas dan pengesanan RNA virus Zika.Asid nukleik boleh diserap/diserap dalam medium lisat/PCR campuran, masing-masing, berdasarkan sifat suis hidup/mati kitosan.hidup dan mati", responsif kepada pH.
Seperti yang dinyatakan di atas, strategi ini menggabungkan kelebihan pelbagai bahan fasa pepejal dan meningkatkan kecekapan pengekstrakan asid nukleik dalam mikrobendalir.Dalam aplikasi praktikal, penggunaan bahan ini dalam kuantiti yang banyak adalah tidak ekonomik, dan rawatan permukaan yang betul atau pengubahsuaian permukaan bahan biasa dengan bahan ini juga boleh mengekalkan fungsinya.Oleh itu, adalah dipercayai bahawa pelaksanaan strategi ini selepas kajian rintis dapat mengurangkan kos.
Ujian asid nukleik pada platform mikrobendalir sering menggunakan volum sampel yang kecil (<100 µl), oleh itu memerlukan penguatan asid nukleik sasaran dengan probe khusus untuk penukaran kepada isyarat yang mudah untuk pengesanan hiliran (optik, elektrik, dan magnet) [53, 54]. Ujian asid nukleik pada platform mikrobendalir sering menggunakan volum sampel yang kecil (<100 µl), oleh itu memerlukan penguatan asid nukleik sasaran dengan probe khusus untuk penukaran kepada isyarat yang mudah untuk pengesanan hiliran (optik, elektrik, dan magnet) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Apabila menguji asid nukleik pada platform mikrobendalir, volum sampel kecil (<100 μL) sering digunakan, jadi penguatan asid nukleik sasaran dengan probe khas diperlukan untuk menukarnya menjadi isyarat yang mudah untuk pengesanan berikutnya (optik, elektrik dan magnet) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 通常 使用 小样本量 (<100 μl), 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸, 以 转换 为 便于 下游 下游 检测 (光学 、 电学 和 磁学) ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 检测 使用 小样本量 小样本量 ((<100 μl), 因此 需要 特定 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 下游 (光学 、 电学 磁学 磁学 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Pengesanan asid nukleik pada platform mikrobendalir biasanya menggunakan volum sampel yang kecil (<100 μl), yang memerlukan penguatan asid nukleik sasaran dengan probe khas untuk menukarnya kepada isyarat untuk pengesanan seterusnya (optik, elektrik, dan magnet) [53, 54]] .Penguatan asid nukleik dalam mikrobendalir juga boleh mempercepatkan tindak balas, mengoptimumkan had pengesanan, mengurangkan keperluan sampel, dan meningkatkan ketepatan pengesanan [55, 56].Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, dengan merealisasikan pengesanan yang cepat dan tepat, pelbagai kaedah penguatan asid nukleik telah digunakan dalam mikrobendalir, termasuk PCR dan beberapa tindak balas penguatan isoterma.Bahagian ini akan meringkaskan kaedah untuk pengesanan asid nukleik berdasarkan sistem mikrofluid.
PCR ialah simulasi proses replikasi DNA sesuatu organisma, yang teorinya diterangkan secara terperinci di tempat lain dan tidak akan dibincangkan di sini.PCR boleh menguatkan sejumlah kecil DNA/RNA sasaran pada kadar eksponen, menjadikan PCR alat yang berkuasa untuk pengesanan pantas asid nukleik.Dalam dekad kebelakangan ini, banyak peranti mikrofluid mudah alih yang dilengkapi dengan sistem kitaran haba PCR telah dibangunkan untuk memenuhi keperluan diagnostik titik penjagaan [57, 58].PCR on-chip boleh dibahagikan kepada empat jenis (konvensional, aliran berterusan, bertukar spatial, dan PCR perolakan) mengikut kaedah kawalan suhu yang berbeza [59].Contohnya, Gee et al.[60] membangunkan kaedah PCR (RT-qPCR) transkripsi terbalik terus pada platform mikrobendalir mereka sendiri untuk pengesanan multipleks virus SARS-CoV-2, influenza A dan B dalam sampel swab tekak (Rajah 3a).Park et al.[61] membina cip analisis patogen mudah dengan menyepadukan PCR filem nipis, elektrod, dan modul mikrobendalir berasaskan polydimethylsiloxane yang dikendalikan jari.Walau bagaimanapun, kedua-dua kerja merangkumi kelemahan biasa PCR konvensional.PCR memerlukan kitaran haba, yang mengehadkan pengecilan peranti selanjutnya dan mengurangkan masa ujian.
Pembangunan PCR mikrofluid berasaskan aliran berterusan dan suis ruang adalah penting untuk menangani isu ini.Menggunakan saluran serpentin yang panjang atau saluran lurus pendek, PCR aliran berterusan boleh memberikan penguatan pantas dengan mengedarkan reagen secara aktif dalam tiga zon prapanas dengan pam luar cip.Operasi ini berjaya mengelakkan fasa peralihan antara suhu tindak balas yang berbeza dan dengan itu mengurangkan masa ujian dengan ketara [62] (Rajah 3b).Dalam kajian lain oleh Jung et al.[63] mencadangkan penganalisis genetik PCR berputar baharu yang menggabungkan ciri PCR tetap dan aliran untuk PCR transkripsi terbalik ultrafast dan multipleks (Rajah 3c).Untuk penguatan asid nukleik, cip mikro PCR akan diputar melalui tiga blok pemanasan pada suhu yang berbeza: 1. Blok pendenaturan 94°C, 2. Blok penyepuhlindapan pada 58°C, 3. Blok pengembangan pada 72°C.
Penggunaan PCR dalam mikrobendalir.Perwakilan skematik dirRT-qPCR pada platform mikrofluid (diadaptasi daripada [60]).b Perwakilan skematik mikroarray PCR aliran berterusan berdasarkan saluran serpentin (diadaptasi daripada [62]).c Perwakilan skematik penganalisis genetik PCR berputar, yang terdiri daripada mikrocip, tiga blok pemanas dan motor stepper (diadaptasi daripada [63]).d Gambar rajah PCR termokoveksi dengan sentrifugasi dan persediaan (diadaptasi daripada [64]).DirRT-qPCR, tindak balas rantai polimerase transkripsi terbalik kuantitatif langsung
Menggunakan kapilari dan gelung atau plat nipis, PCR perolakan boleh menguatkan asid nukleik dengan cepat melalui perolakan haba bebas semula jadi tanpa memerlukan pam luaran.Sebagai contoh, platform mikrobendalir polimer olefin kitaran telah dibangunkan pada peringkat pemanasan berputar yang direka yang menggunakan kitaran haba dengan sentrifugasi dalam saluran mikro gelung PCR [64] (Rajah 3d).Penyelesaian tindak balas didorong oleh perolakan terma, yang secara berterusan menukar suhu tinggi dan rendah dalam saluran mikro dengan struktur anulus.Keseluruhan proses amplifikasi boleh diselesaikan dalam masa 10 minit dengan had pengesanan 70.5 pg/saluran.
Seperti yang dijangkakan, PCR pantas ialah alat yang berkuasa untuk sistem analisis molekul sampel-tindak balas bersepadu sepenuhnya dan analisis multipleks.PCR pantas mengurangkan dengan ketara masa yang diperlukan untuk mengesan SARS-CoV-2, yang menyumbang kepada kawalan berkesan wabak COVID-19.
PCR memerlukan kitar haba kompleks yang tidak sesuai untuk POCT.Baru-baru ini, teknik penguatan isoterma telah digunakan untuk mikrobendalir, termasuk tetapi tidak terhad kepada LAMP, recombinase polymerase amplification (RPA), dan amplifikasi berdasarkan urutan asid nukleik [65,66,67,68].Dengan teknik ini, asid nukleik dikuatkan pada suhu malar, memudahkan penciptaan peranti POCT mudah alih kos rendah yang sangat sensitif untuk diagnostik molekul.
Ujian LAMP berasaskan mikrobendalir tinggi membolehkan pengesanan pelbagai penyakit berjangkit [42, 69, 70, 71].Dalam kombinasi dengan sistem mikrofluidik emparan, LAMP boleh memudahkan lagi automasi pengesanan asid nukleik [69, 72, 73, 74, 75].SlipChip spin-and-react telah dibangunkan untuk pengesanan visual berbilang bakteria selari menggunakan LAMP [76] (Rajah 4a).Apabila menggunakan LAMP yang dioptimumkan dalam ujian, nisbah isyarat-ke-bunyi pendarfluor adalah lebih kurang 5 kali ganda, dan had pengesanan mencapai 7.2 salinan/μl DNA genomik. Selain itu, kewujudan lima patogen bakteria pencernaan biasa, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, telah divisualisasikan berdasarkan kaedah dalam <60 min. Selain itu, kewujudan lima patogen bakteria pencernaan biasa, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, telah divisualisasikan berdasarkan kaedah dalam <60 min.Selain itu, kehadiran lima patogen bakteria biasa saluran pencernaan, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis dan Vibrio parahaemolyticus, telah divisualisasikan menggunakan kaedah ini dalam masa kurang daripada 60 minit.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在, 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在, 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPDi samping itu, kehadiran lima patogen gastrousus bakteria biasa, termasuk Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius, dan Vibrio parahaemolyticus, telah divisualisasikan menggunakan kaedah ini dalam masa kurang daripada 60 minit.
Kelebihan LAMP dalam mikrobendalir termasuk, antara lain, tindak balas pantas dan pengesanan kecil.Walau bagaimanapun, disebabkan oleh suhu tindak balas (sekitar 70°C), aerosol tidak dapat dielakkan dijana semasa LAMP, menghasilkan kadar positif palsu yang tinggi.Kekhususan ujian, reka bentuk primer dan kawalan suhu juga perlu dioptimumkan untuk LAMP.Selain itu, reka bentuk cip yang melaksanakan pengesanan sasaran berbilang pada satu cip adalah bernilai tinggi dan harus dibangunkan.Di samping itu, LAMP sesuai untuk pengesanan pelbagai guna yang disepadukan dalam satu cip, yang sangat penting, tetapi masih terdapat banyak ruang untuk pembangunan.
Kadar positif palsu LAMP yang tinggi boleh dikurangkan sebahagiannya dengan RPA, kerana suhu tindak balas yang agak rendah (~37 °C) mengakibatkan masalah penyejatan yang agak sedikit [77].Dalam sistem RPA, dua primer bertentangan memulakan sintesis DNA dengan mengikat rekombinasi dan amplifikasi boleh diselesaikan dalam masa 10 minit [78,79,80,81].Oleh itu, keseluruhan proses RPA jauh lebih cepat daripada PCR atau LAMP.Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, teknologi mikrofluidik telah ditunjukkan untuk meningkatkan lagi kelajuan dan ketepatan RPA [82,83,84].Contohnya, Liu et al.[85] membangunkan ujian penguatan polimerase rekombinasi aliran sisi mikrofluidik bersepadu untuk pengesanan pantas dan sensitif SARS-CoV-2 dengan menyepadukan RPA transkripsi terbalik (RT-RPA) dan sistem pengesan jalur ujian aliran sisi sejagat.ke dalam satu sistem mikrobendalir tunggal.Rajah 4b).Had pengesanan ialah 1 salinan/µl atau 30 salinan/sampel, dan pengesanan boleh diselesaikan dalam masa kira-kira 30 minit.Kong et al.telah membangunkan peranti mikrobendalir boleh pakai.[86] menggunakan suhu badan dan sistem pengesanan pendarfluor berasaskan telefon mudah alih untuk mengesan DNA HIV-1 dengan pantas dan terus menggunakan RPA (Rajah 4c).Ujian RPA boleh pakai mengesan 100 salinan/mL jujukan sasaran dalam masa 24 minit, menunjukkan potensi besar untuk diagnosis pantas bayi yang dijangkiti HIV-1 dalam tetapan terhad sumber.
Penguatan isoterma dalam ujian titik penjagaan (POCT).Pembangunan dan penghasilan spin dan tindak balas SlipChip.Selepas kimpalan plasma, cip atas dan bawah dipasang dengan satu set kacang untuk membentuk cip akhir (diadaptasi daripada [76]).b Skema sistem MI-IF-RPA untuk pengesanan COVID-19 (diadaptasi daripada [85]).c Skema ujian RPA boleh pakai untuk pengesanan pantas DNA HIV-1 (diadaptasi daripada [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, virus immunodeficiency manusia HIV, penguatan polimerase rekombinasi RPA, diod pemancar cahaya LED, MI-IF-RPA Microfluidics Polylow Integrated Lacombina Semula MI-IF-RPA Penguatan
RPA berasaskan mikrobendalir sedang berkembang pesat, namun, kos fabrikasi cip dan penggunaan tindak balas adalah terlalu tinggi dan mesti dikurangkan untuk meningkatkan ketersediaan teknologi ini.Di samping itu, kepekaan tinggi RPA boleh menjejaskan penguatan produk bukan khusus, terutamanya dengan kehadiran pencemaran.Keterbatasan ini boleh menjejaskan penggunaan RPA dalam sistem mikrofluid dan merit pengoptimuman selanjutnya.Primer dan probe yang direka dengan baik untuk pelbagai sasaran juga diperlukan untuk meningkatkan kebolehlaksanaan strategi mikrofluidik berasaskan RPA dalam POCT.
Cas13 dan Cas12a mempunyai keupayaan untuk membelah asid nukleik secara rawak dan dengan itu boleh dibangunkan sebagai alat pengesanan dan diagnostik.Cas13 dan Cas12a diaktifkan apabila mengikat DNA atau RNA sasaran, masing-masing.Sebaik sahaja diaktifkan, protein mula membelah asid nukleik lain yang berdekatan, selepas itu membimbing RNA yang menyasarkan asid nukleik khusus patogen boleh membelah probe pendarfluor yang dipadamkan dan melepaskan pendarfluor.Berdasarkan teori ini, Kellner et al.[87] membangunkan kaedah berasaskan Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], dan Broughton et al.[88] membangunkan pendekatan lain berdasarkan Cas12a [CRISPR Trans Reporter mensasarkan DNA endonuclease (DTECR)].
Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, pelbagai kaedah untuk pengesanan asid nukleik berdasarkan CRISPR telah muncul [89, 90].Kaedah berasaskan CRISPR konvensional selalunya memakan masa dan intensif buruh kerana pelbagai prosedur termasuk pengekstrakan asid nukleik, amplifikasi dan pengesanan CRISPR.Pendedahan cecair kepada udara boleh meningkatkan peluang keputusan positif palsu.Memandangkan perkara di atas, sistem berasaskan CRISPR sangat memerlukan pengoptimuman.
Platform mikrofluidik yang dikawal secara pneumatik yang boleh melakukan 24 analisis secara selari telah dibangunkan untuk aplikasi pengesanan CRISPR-Cas12a dan CRISPR-Cas13a [91].Sistem ini dilengkapi dengan peranti pengesan pendarfluor yang memintas penguatan asid nukleik dan secara automatik mengesan sampel DNA dan RNA femtomolar.Chen et al.[92] penguatan rekombinasi bersepadu dengan sistem CRISPR-Cas12a dalam mikrobendalir sentrifugal (Rajah 5a).Kerja ini mengatasi kesukaran mengintegrasikan kedua-dua proses ini kerana Cas12a boleh mencerna DNA utusan dan menghalang proses amplifikasi.Di samping itu, Chen et al.[92] selain itu, pra-simpan reagen tindak balas dalam kawalan mikrobendalir emparan untuk melengkapkan keseluruhan proses secara automatik.Dalam karya lain, Silva et al.[93] membangunkan kaedah diagnostik tanpa amplifikasi CRISPR/Cas12a dan telefon pintar untuk mengesan SARS-CoV-2 (Rajah 5b).Ujian ini, yang dikenali sebagai sistem tanpa amplifikasi berasaskan telefon bimbit, termasuk enzim yang bergantung kepada CRISPR/Cas yang berdasarkan visualisasi telefon pintar isyarat gelembung yang dijanakan katalase dalam saluran mikrofluid.Pengesanan sensitif kurang daripada 50 salinan/µl asid nukleik tanpa pra-penguatan, keseluruhan proses daripada suntikan sampel kepada bacaan isyarat mengambil masa hanya 71 minit.
Kaedah pengesanan asid nukleik berdasarkan CRISPR.POCT sentrifugal untuk diagnostik molekul bersepadu berdasarkan CRISPR (diadaptasi daripada [92]).b Pembangunan ujian CASCADE untuk analisis berasaskan telefon pintar SARS-CoV-2 (diadaptasi daripada [93]).Penguatan rekombinasi RAA, motif protospacer bersebelahan PAM, ulangan palindromik pendek berkelompok CRISPR pada selang masa yang tetap, sistem CASCADE tanpa amplifikasi telefon bimbit dengan enzim yang bergantung kepada CRISPR/CAS, 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC
Sebagai langkah terakhir dalam pengesanan asid nukleik, pengesanan isyarat secara langsung mencerminkan keputusan diagnostik dan merupakan faktor kritikal dalam pembangunan POCT yang cekap, sensitif dan tepat.Isyarat boleh dibaca menggunakan pelbagai kaedah seperti strategi pendarfluor, elektrokimia, kolorimetrik dan magnet.Dalam bahagian ini, kami menerangkan rasional bagi setiap pendekatan dan membandingkan diagnostik molekul penyakit berjangkit dalam mikrobendalir.
Strategi berasaskan pendarfluor digunakan secara meluas untuk diagnostik POCT penyakit berjangkit kerana kelebihan luar biasa mereka iaitu kepekaan yang sangat baik, kos rendah, kemudahan operasi, dan analisis titik penjagaan [94, 95].Strategi ini menggunakan pendarfluor berlabel seperti pewarna pendarfluor dan bahan nano untuk mencipta isyarat yang boleh dikesan (peningkatan pendarfluor atau pelindapkejutan).Dapatan ini menunjukkan bahawa strategi berasaskan pendarfluor boleh dibahagikan kepada pelabelan pendarfluor langsung, isyarat hidup, dan pengesanan pendarfluor isyarat mati [96].Pengesanan label pendarfluor langsung menggunakan label pendarfluor khas untuk melabel ligan tertentu yang menghasilkan jumlah pendarfluor tertentu apabila terikat secara selektif pada sasaran.Untuk pengesanan pendarfluor berasaskan isyarat, kualiti isyarat pendarfluor berkaitan secara positif dengan magnitud minat.Keamatan pendarfluor boleh diabaikan jika tiada sasaran dan dapat dikesan apabila jumlah sasaran yang mencukupi hadir.Sebaliknya, keamatan pendarfluor yang dikesan oleh pendarfluor "mematikan isyarat" adalah berkadar songsang dengan jumlah sasaran, pada mulanya mencapai nilai maksimum dan secara beransur-ansur berkurangan apabila sasaran diperbesarkan.Sebagai contoh, menggunakan mekanisme trans-cleavage yang bergantung kepada sasaran CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] membangunkan strategi pengecaman baru untuk mengesan RNA yang memintas transkripsi terbalik secara langsung (Rajah 6a).Apabila mengikat kepada RNA sasaran pelengkap, kompleks CRISPR-Cas13-RNA boleh diaktifkan, mencetuskan belahan transkolateral oleh RNA wartawan bukan spesifik.Wartawan berlabel pendarfluor [fluorophore (F)] dipadamkan oleh pelindapkejut (Q) utuh dan pendarfluor apabila dibelah oleh kompleks diaktifkan.
Kelebihan pengesanan elektrokimia adalah kelajuan pengesanan tinggi, pengeluaran mudah, kos rendah, mudah dibawa dan kawalan automatik.Ia adalah kaedah analisis yang berkuasa untuk aplikasi POCT.Berdasarkan transistor kesan medan graphene Gao et al.[98] membangunkan nanobiosensor untuk pengesanan multipleks antigen penyakit Lyme daripada bakteria Borrelia burgdorferi dengan had pengesanan 2 pg/mL (Rajah 6b).
Ujian kolorimetrik telah digunakan dalam aplikasi POCT, mendapat manfaat daripada kelebihan mudah alih, kos rendah, kemudahan penyediaan dan bacaan visual.Pengesanan kolorimetrik boleh menggunakan pengoksidaan bahan nano seperti peroksidase atau peroksidase, pengagregatan bahan nano, dan penambahan pewarna penunjuk untuk menukar maklumat tentang kehadiran asid nukleik sasaran kepada perubahan warna yang boleh dilihat [99, 100, 101].Terutamanya, nanopartikel emas digunakan secara meluas dalam pembangunan strategi kolorimetrik, dan kerana keupayaan mereka untuk mendorong perubahan warna yang cepat dan ketara, terdapat peningkatan minat dalam pembangunan platform kolorimetrik POCT untuk diagnosis in situ penyakit berjangkit [102].Dengan peranti mikrobendalir emparan bersepadu [103], patogen bawaan makanan dalam sampel susu yang tercemar boleh dikesan secara automatik pada tahap 10 sel bakteria, dan hasilnya boleh dibaca secara visual dalam masa 65 minit (Rajah 6c).
Teknik penderiaan magnetik dapat mengesan analit dengan tepat menggunakan bahan magnetik, dan terdapat minat yang ketara dalam aplikasi POCT dalam beberapa dekad kebelakangan ini.Teknik penderiaan magnet mempunyai beberapa kelebihan unik seperti bahan magnet kos rendah berbanding komponen optik yang mahal.Walau bagaimanapun, penggunaan medan magnet meningkatkan kecekapan pengesanan dan mengurangkan masa penyediaan sampel [104].Di samping itu, keputusan probing magnet menunjukkan kekhususan yang tinggi, kepekaan, dan nisbah isyarat-ke-bunyi yang tinggi disebabkan oleh isyarat latar belakang magnet yang tidak ketara bagi sampel biologi [105].Sharma et al.menyepadukan biosensor berasaskan simpang terowong magnetik ke dalam platform mikrocip mudah alih.[106] untuk pengesanan multipleks patogen (Rajah 6d).Biosensor secara sensitif mengesan asid nukleik subnanomolar yang diasingkan daripada patogen.
Kaedah pengesanan isyarat biasa.Konsep pengesanan hiperlokal bagi Cas13a (diadaptasi daripada [97]).b Graphene nanobiosensor FET dalam kombinasi dengan Lyme GroES scFv (diadaptasi daripada [98]).c Petunjuk kolorimetrik untuk pengesanan multipleks patogen bawaan makanan dalam cip mikrofluidik emparan: sampel No. 1 dan No. 3 dengan patogen sasaran, dan sampel No. 2, No. 4 dan No. 5 tanpa patogen sasaran (diadaptasi daripada [103]) .d Biosensor berdasarkan persimpangan terowong magnetik, termasuk platform, penguat penyekat terbina dalam, unit kawalan dan bekalan kuasa untuk penjanaan/pemerolehan isyarat (diadaptasi daripada [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
Walaupun ciri-ciri cemerlang kaedah pengesanan di atas, mereka masih mempunyai kelemahan.Kaedah ini dibandingkan (jadual 1), termasuk beberapa aplikasi dengan butiran (kebaikan dan keburukan).
Dengan pembangunan mikrobendalir, sistem mikroelektromekanikal, nanoteknologi dan sains bahan, penggunaan cip mikrobendalir untuk pengesanan penyakit berjangkit sentiasa berkembang [55,96,107,108].Manipulasi tepat peralatan dan cecair kecil menyumbang kepada ketepatan diagnostik dan keberkesanan kos.Oleh itu, untuk pembangunan selanjutnya, usaha telah dibuat untuk mengoptimumkan dan menaik taraf cip, menghasilkan pelbagai cip mikrofluidik dengan struktur dan fungsi yang berbeza.Di sini kami memperkenalkan secara ringkas beberapa jenis platform mikrofluid biasa dan membandingkan ciri-cirinya (kebaikan dan keburukan).Di samping itu, kebanyakan contoh yang disenaraikan di bawah memberi tumpuan terutamanya pada memerangi SARS-CoV-2.
LOCC ialah sistem analitik kompleks miniatur yang paling biasa dan operasinya sangat kecil, bersepadu, automatik dan selari daripada suntikan dan penyediaan sampel, kawalan aliran dan pengesanan cecair [109, 110].Cecair dimanipulasi melalui geometri yang direka dengan teliti dan interaksi banyak kesan fizikal seperti kecerunan tekanan, tindakan kapilari, elektrodinamik, medan magnet dan gelombang akustik [111].LOCC menunjukkan kelebihan yang sangat baik dalam penapisan pemprosesan tinggi dan pengesanan berbilang, dengan kelajuan analisis yang pantas, saiz sampel yang kecil, penggunaan kuasa yang rendah, dan kecekapan pengurusan dan operasi yang tinggi;walau bagaimanapun, peranti LOCC sangat halus, dan pembuatan, pembungkusan dan antara muka.Walau bagaimanapun, pemultipleksan dan penggunaan semula menghadapi kesukaran yang besar [96].Berbanding dengan platform lain, LOCC mempunyai kelebihan unik dari segi kepelbagaian aplikasi maksimum dan keserasian teknologi terbaik, tetapi kelemahannya juga jelas, iaitu kerumitan tinggi dan kebolehulangan yang lemah.Pergantungan pada pam luaran, yang selalunya besar dan mahal, mengehadkan lagi penggunaannya dalam POCT.
Semasa wabak COVID-19, LOCC mendapat banyak perhatian.Pada masa yang sama, terdapat beberapa cip baharu yang menggabungkan beberapa teknologi.Sebagai contoh, telefon pintar kini digunakan secara meluas sebagai peranti analitik mudah alih dan mempunyai potensi besar untuk penyepaduan LOCC.Sun et al.[21] merekacipta cip mikrobendalir yang membolehkan pemultipleksan jujukan asid nukleik khusus bagi lima patogen, termasuk SARS-CoV-2, menggunakan LAMP dan menganalisisnya menggunakan telefon pintar dalam masa 1 jam selepas tamat tindak balas.Sebagai contoh lain, Sundah et al.[112] mencipta suis molekul [penguatan pemangkin oleh suis keadaan peralihan molekul (CATCH)] untuk pengesanan langsung dan sensitif sasaran RNA SARS-CoV-2 menggunakan telefon pintar. CATCH serasi dengan LOCC mudah alih dan mencapai prestasi unggul (kira-kira 8 salinan RNA/μl; <1 jam pada suhu bilik) [112]. CATCH serasi dengan LOCC mudah alih dan mencapai prestasi unggul (kira-kira 8 salinan RNA/μl; <1 jam pada suhu bilik) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мктл; < 1 темкт; < 1 темкт; CATCH serasi dengan LOCC mudah alih dan memberikan daya pemprosesan yang sangat baik (kira-kira 8 salinan RNA/µl; < 1 jam pada suhu bilik) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (contoh 8 копий РНК/мкпл; < 1 копий РНК/мкпл; CATCH serasi dengan LOCC mudah alih dan mempunyai prestasi cemerlang (kira-kira 8 salinan RNA/µl; < 1 jam pada suhu bilik) [112].Selain itu, peranti LOCC untuk diagnostik molekul juga menggunakan beberapa daya penggerak seperti vakum, regangan dan medan elektrik.Kang et al.[113] menunjukkan PCR nanoplasma-on-a-chip masa nyata ultra-pantas untuk diagnosis pantas dan kuantitatif COVID-19 di lapangan menggunakan cip PCR cecair plasmonik vakum.Li et al.[114] kemudiannya membangunkan cip mikrofluidik terdorong regangan yang membolehkan diagnosis COVID-19.Platform menggunakan sistem penguatan RT-LAMP untuk menentukan sama ada sampel adalah positif atau negatif secara kualitatif.Selepas itu, Ramachandran et al.[115] mencapai kecerunan medan elektrik yang sesuai menggunakan isotachophoresis (ITP), teknik pemfokusan ion terpilih yang dilaksanakan dalam mikrobendalir.Dengan ITP, RNA sasaran daripada sampel swab nasofaring mentah boleh disucikan secara automatik.Kemudian Ramachandran et al.[115] Menggabungkan penulenan ITP ini dengan LAMP dipertingkatkan ITP dan ujian CRISPR mengesan SARS-CoV-2 dalam swab nasofaring manusia dan spesimen klinikal dalam masa kira-kira 35 minit.Di samping itu, idea-idea baru sentiasa muncul.Jadhav et al.[116] mencadangkan skim diagnostik berdasarkan spektroskopi Raman yang dipertingkatkan permukaan dalam kombinasi dengan peranti mikrobendalir yang mengandungi sama ada tiub nano karbon bersalut emas/perak berorientasikan menegak atau mikro/nanotiub elektrospun pakai buang.Saluran mikro penapis terbina dalam yang berfungsi dengan membran boleh guna.Peranti ini menyerap virus daripada pelbagai cecair/eksudasi badan seperti air liur, nasofaring dan air mata.Oleh itu, titer virus adalah banyak dan virus boleh dikenal pasti dengan tepat oleh tandatangan Raman.
LOAD ialah platform mikrofluidik emparan di mana semua proses dikawal oleh protokol frekuensi yang memutarkan substrat berstruktur mikro [110].Peranti LOAD dicirikan dengan menggunakan daya emparan sebagai daya penggerak yang penting.Cecair juga tertakluk kepada daya kapilari, Euler dan Coriolis.Menggunakan peranti emparan, analisis dilakukan dalam operasi cecair berterusan dari kedudukan jejari ke dalam ke luar, menghapuskan keperluan untuk tiub luaran tambahan, pam, penggerak dan injap aktif.Ringkasnya, kaedah kawalan tunggal memudahkan operasi.Daya yang bertindak ke atas cecair dalam saluran mikrofluid yang sama pada jarak yang sama dari pusat beban adalah sama, yang memungkinkan untuk mengulangi struktur saluran.Oleh itu, peralatan LOAD adalah lebih mudah dan lebih menjimatkan untuk mereka bentuk dan mengeluarkan daripada peralatan LOCC konvensional, manakala tindak balas sebahagian besarnya bebas dan selari;bagaimanapun, disebabkan kekuatan mekanikal peralatan emparan yang tinggi, bahan cip yang ada adalah terhad dan volum yang kecil sukar.ke kereta.Pada masa yang sama, kebanyakan peranti LOAD direka untuk kegunaan tunggal sahaja, yang mahal untuk pengesanan berskala besar [96, 117, 118, 119].
Dalam dekad kebelakangan ini, LOAD, yang dianggap sebagai salah satu peranti mikrobendalir yang paling menjanjikan, telah mendapat perhatian yang besar daripada penyelidik dan pengilang.Oleh itu, LOAD telah mendapat penerimaan meluas dan telah digunakan untuk diagnostik molekul patogen berjangkit [120, 121, 122, 123, 124], terutamanya semasa wabak COVID-19.Sebagai contoh, pada akhir tahun 2020, Ji et al.[60] menunjukkan ujian RT-qPCR langsung untuk pengesanan selari pantas dan automatik bagi jangkitan SARS-CoV-2 dan influenza A dan B dalam spesimen swab tekak.Kemudian Xiong et al.[74] mempersembahkan platform mikrofluidik diskoid bersepadu LAMP untuk pengesanan pantas, tepat dan serentak tujuh coronavirus pernafasan manusia, termasuk SARS-CoV-2, dalam masa 40 minit.Pada awal 2021, de Oliveira et al.[73] menunjukkan cip mikrobendalir empar toner polistirena, dikendalikan secara manual dengan pemutar hujung jari, untuk diagnosis molekul RT-LAMP COVID-19.Selepas itu, Dignan et al.[39] mempersembahkan peranti mikro empar mudah alih automatik untuk penulenan RNA SARS-CoV-2 terus daripada bahagian swab bukal.Medved et al.[53] mencadangkan sistem persampelan aerosol SARS-CoV-2 sebaris dengan cip pendarfluor mikrofluidik berputar volum kecil dengan had pengesanan 10 salinan/μL dan ambang kitaran minimum 15 minit.Suarez et al.[75] baru-baru ini melaporkan pembangunan platform mikrobendalir empar modular bersepadu untuk pengesanan langsung RNA SARS-CoV-2 dalam sampel swab nasofaring yang tidak diaktifkan haba menggunakan LAMP.Contoh-contoh ini menunjukkan faedah dan janji LOAD yang hebat dalam diagnostik molekul COVID-19.
Pada tahun 1945 Muller dan Clegg [125] pertama kali membentangkan saluran mikrofluid di atas kertas menggunakan kertas penapis dan parafin.Pada tahun 2007, kumpulan Whitesides [126] mencipta platform kertas berfungsi pertama untuk ujian protein dan glukosa.Kertas telah menjadi substrat yang ideal untuk mikrobendalir.Kertas itu mempunyai sifat yang wujud seperti hidrofilik dan struktur berliang, biokompatibiliti yang sangat baik, ringan, fleksibiliti, kebolehlipatan, kos rendah, kemudahan penggunaan dan kemudahan.µPAD klasik terdiri daripada struktur hidrofilik/hidrofobik yang dibina di atas substrat kertas.Bergantung kepada struktur tiga dimensi, μPAD boleh dibahagikan kepada μPAD dua dimensi (2D) dan tiga dimensi (3D).µPAD 2D dihasilkan dengan membentuk sempadan hidrofobik untuk membentuk saluran mikrobendalir, manakala µPAD 3D biasanya dibuat daripada susunan lapisan kertas mikrobendalir 2D, kadangkala dengan lipatan kertas, teknik gelinciran, saluran terbuka, dan pencetakan 3D [96].Cecair akueus atau biologi pada μPAD dikawal terutamanya oleh daya kapilari tanpa sumber kuasa luaran, memudahkan pra-penyimpanan reagen, pengendalian sampel dan pengesanan multipleks.Walau bagaimanapun, kawalan aliran yang tepat dan pengesanan multipleks dihalang oleh kelajuan pengesanan, kepekaan dan kebolehgunaan semula yang tidak mencukupi [96, 127, 128, 129, 130].
Sebagai platform mikrofluid yang luar biasa, μPAD telah dipromosikan secara meluas dan dibangunkan untuk diagnosis molekul penyakit berjangkit seperti HCV, HIV dan SARS-CoV-2 [131, 132].Untuk pengesanan terpilih dan sensitif HCV, Tengam et al.[133] membangunkan biosensor novel berdasarkan kertas pendarfluor menggunakan probe asid nukleik yang sangat spesifik berdasarkan peptida pyrrolidinyl.Asid nukleik diimobilisasikan secara kovalen pada kertas selulosa teroksida separa melalui alkilasi reduktif antara kumpulan amino dan kumpulan aldehid, dan pengesanan adalah berdasarkan pendarfluor.Isyarat ini boleh dibaca oleh alat yang dibuat khas dengan kamera pendarfluor mudah alih yang digabungkan dengan kamera telefon bimbit.Selepas itu, Lu et al.[134] mereka bentuk elektrod fleksibel berasaskan kertas berdasarkan nanopartikel nikel/emas/karbon nanotiub/polivinil alkohol rangka kerja organologam komposit untuk pengesanan sasaran HIV melalui hibridisasi DNA menggunakan metilena biru sebagai penunjuk DNA redoks.Baru-baru ini, Chowdury et al.[135] mempersembahkan reka bentuk platform hipotesis untuk ujian µPAD titik penjagaan menggunakan air liur pesakit mentah dalam kombinasi dengan LAMP dan teknologi pengimejan mudah alih untuk pengesanan analit COVID-19.
Ujian aliran sisi membimbing cecair mengikut daya kapilari dan mengawal pergerakan bendalir dengan kebolehbasahan dan ciri substrat berliang atau berstruktur mikro.Peranti aliran sisi terdiri daripada sampel, konjugat, inkubator dan pengesanan, dan pad penyerap.Molekul asid nukleik dalam LFA mengiktiraf pengikat khusus yang pra-simpan di tapak pengikatan dan mengikat sebagai kompleks.Apabila cecair melalui plat pengeraman dan pengesanan, kompleks ditangkap oleh molekul penangkapan yang terletak pada garisan ujian dan kawalan, menunjukkan hasil yang boleh dibaca terus dengan mata kasar.Biasanya, LFA boleh disiapkan dalam masa 2-15 minit, yang lebih cepat daripada penemuan tradisional.Disebabkan oleh mekanisme khas, LFA memerlukan sedikit operasi dan tidak memerlukan peralatan tambahan, yang menjadikannya sangat mesra pengguna.Ia mudah untuk dihasilkan dan dikecilkan, dan kos substrat berasaskan kertas lebih rendah.Walau bagaimanapun, ia hanya digunakan untuk analisis kualitatif, dan pengesanan kuantitatif adalah sangat sukar, dan keupayaan pemultipleksan dan daya pemprosesan adalah sangat terhad, dan hanya satu asid nukleik yang mencukupi dapat dikesan pada satu masa [96,110,127].
Walaupun kebanyakan aplikasi LFA tertumpu pada immunoassays, penggunaan LFA untuk diagnostik molekul dalam cip mikrofluid juga berkesan dan popular [136].Dalam kes virus hepatitis B, HIV dan SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] mencadangkan platform LFA nanopartikel penukaran naik dan menunjukkan kepelbagaian platform kecil dan mudah alih ini melalui pengesanan sensitif dan kuantitatif berbilang sasaran seperti asid nukleik HBV.Di samping itu, Fu et al.[138] menunjukkan LFA novel berdasarkan spektroskopi Raman yang dipertingkatkan permukaan untuk analisis kuantitatif DNA HIV-1 pada kepekatan rendah.Untuk pengesanan pantas dan sensitif SARS-CoV-2, Liu et al.[85] membangunkan analisis aliran sisi RPA bersepadu mikrobendalir dengan menggabungkan RT-RPA dan sistem pengesanan aliran sisi sejagat ke dalam sistem mikrobendalir tunggal.
Aplikasi pelbagai platform mikrobendalir berbeza-beza bergantung pada kajian khusus, memanfaatkan sepenuhnya keupayaan dan kelebihan platform.Dengan injap, pam dan saluran mampu milik, LOCC ialah platform paling komprehensif untuk kepelbagaian aplikasi dan kesalingoperasian dengan ruang yang paling besar untuk pembangunan.Oleh itu, kami berharap dan mengesyorkan agar kajian terbaru dijalankan di LOCC sebagai percubaan pertama dan syarat-syaratnya dioptimumkan.Di samping itu, kaedah yang lebih cekap dan tepat dijangka ditemui dan digunakan dalam sistem.LOAD cemerlang dalam kawalan tepat cecair daripada peranti LOCC sedia ada dan menunjukkan kelebihan unik dalam pemacu tunggal dengan daya emparan tanpa memerlukan pemacu luaran, manakala tindak balas selari boleh diasingkan dan disegerakkan.Oleh itu, pada masa hadapan, LOAD akan menjadi platform mikrobendalir utama dengan kurang operasi manual dan teknologi yang lebih matang dan automatik.Platform µPAD menggabungkan faedah LOCC dan bahan berasaskan kertas untuk diagnostik penggunaan tunggal berkos rendah.Oleh itu, pembangunan masa depan harus memberi tumpuan kepada teknologi yang mudah dan mantap.Selain itu, LFA sangat sesuai untuk pengesanan mata kasar, menjanjikan untuk mengurangkan penggunaan sampel dan mempercepatkan pengesanan.Perbandingan platform terperinci ditunjukkan dalam Jadual 2.
Analisis digital membahagikan sampel kepada banyak mikroreaktor, setiap satunya mengandungi bilangan diskret molekul sasaran [139, 140].Ujian digital menawarkan kelebihan ketara untuk melaksanakan kuantiti mutlak dengan melakukan beribu-ribu eksperimen biokimia selari secara serentak dan secara individu dalam petak skala mikron dan bukannya dalam fasa berterusan.Berbanding dengan mikrobendalir tradisional, tindak balas petak boleh mengurangkan jumlah sampel, meningkatkan kecekapan tindak balas, dan mudah disepadukan dengan kaedah analisis lain tanpa memerlukan saluran, pam, injap dan reka bentuk padat [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Dua kaedah berikut digunakan dalam ujian digital untuk mencapai pengasingan seragam dan tepat bagi penyelesaian, termasuk reagen dan sampel seperti sel, asid nukleik, dan zarah atau molekul lain: (1) emulsi jatuh yang mengeksploitasi ketidakstabilan antara muka cecair;(2) pembahagian tatasusunan dijalankan oleh kekangan geometri peranti.Dalam kaedah pertama, titisan yang mengandungi reagen dan sampel dalam saluran mikro boleh dibuat melalui kaedah pasif seperti arus bersama, aliran silang, pemfokusan aliran, pengemulsi berperingkat, pengemulsi saluran mikro, dan membran melalui daya ricih likat dan pengemulsi dengan perubahan saluran.penyetempatan [143, 145, 146, 148, 149] atau menggunakan kaedah aktif [150, 151], yang memperkenalkan tenaga tambahan melalui kawalan elektrik, magnet, haba dan mekanikal.Dalam pendekatan yang terakhir, keseragaman isipadu cecair terbaik dalam ruang mikrobendalir dikongsi dengan mengekalkan struktur ruang pada saiz yang sama, seperti lubang mikro dan tatasusunan permukaan [152,153,154].Terutamanya, titisan adalah bahagian aliran utama yang juga boleh dijana dan dimanipulasi pada tatasusunan elektrod berdasarkan mikrofluidik digital (DMF).Elektrowetan dielektrik adalah salah satu teori DMF yang terbaik dikaji, kerana electrowetting dielektrik membolehkan manipulasi tepat titisan individu, mengawal bentuk cecair dan isyarat elektrik asimetri yang melalui sisi yang berbeza [141, 144].Operasi utama dengan titisan dalam DMF termasuk pengisihan, pemisahan dan penggabungan [151, 155, 156], yang boleh digunakan dalam pelbagai bidang analisis, terutamanya dalam pengesanan molekul [157, 158, 159].
Pengesanan asid nukleik digital ialah teknologi diagnostik molekul generasi ketiga berikutan PCR konvensional dan PCR masa nyata kuantitatif (qPCR), selari dengan penjujukan pemprosesan tinggi dan biopsi cecair.Dalam dua dekad yang lalu, asid nukleik digital telah berkembang pesat dalam bidang diagnostik molekul patogen berjangkit [160, 161, 162].Kuantifikasi mutlak pengesanan asid nukleik digital bermula dengan pembungkusan sampel dan reagen ke dalam petak individu untuk memastikan bahawa setiap jujukan sasaran mempunyai kebarangkalian yang sama untuk memasuki setiap petak individu.Secara teorinya, setiap bahagian mungkin diberikan berbilang jujukan sasaran, atau mungkin tidak ada sistem mikrotindak balas bebas.Melalui pelbagai mekanisme penderiaan yang diterangkan di atas, petak dengan jujukan sasaran mikrob yang menjana isyarat di atas ambang tertentu boleh divisualisasikan dengan mata kasar atau oleh mesin dan dilabel sebagai positif, manakala petak lain yang menjana isyarat di bawah ambang dilabel sebagai positif .yang negatif, yang menjadikan isyarat untuk setiap bahagian sebagai boolean.Oleh itu, dengan mengira bilangan petak yang dicipta dan kadar keputusan positif selepas tindak balas, salinan asal sampel ujian boleh dipadankan menggunakan formula taburan Poisson tanpa memerlukan lengkung piawai, yang diperlukan untuk analisis kuantitatif rutin seperti sebagai qPCR.[163] Berbanding dengan kaedah diagnostik molekul tradisional, pengesanan asid nukleik digital mempunyai tahap automasi yang lebih tinggi, kelajuan dan kepekaan analisis yang lebih tinggi, lebih sedikit reagen, kurang pencemaran, dan reka bentuk dan pembuatan yang lebih mudah.Atas sebab ini, penggunaan ujian digital, terutamanya kaedah berasaskan drop, untuk diagnostik molekul, menggabungkan penguatan dan teknik pembacaan isyarat, telah dikaji dengan baik semasa wabak kritikal SARS-CoV-2.Sebagai contoh, Yin et al.[164] menggabungkan kaedah digital titisan dan PCR pantas untuk mengesan gen ORF1ab, N, dan RNase P dalam SARS-CoV-2 dalam cip mikrofluid.Terutama, sistem itu dapat mengenal pasti isyarat positif dalam masa 115 saat, yang lebih pantas daripada PCR konvensional, menunjukkan keberkesanannya dalam pengesanan titik penjagaan (Rajah 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] dan Alteri et al.[167] juga menggunakan PCR digital titisan (ddPCR) untuk mengesan SARS-CoV-2 dalam sistem mikrobendalir dengan hasil yang mengagumkan.Untuk meningkatkan lagi kadar pengesanan, Shen et al.[168] mencapai pengimejan cip berasaskan ddPCR dalam masa seawal 15 saat tanpa menggunakan teknik jahitan imej, mempercepatkan proses teknologi ddPCR dari makmal ke aplikasi.Bukan sahaja kaedah penguatan haba seperti PCR digunakan, tetapi kaedah penguatan isoterma juga digunakan untuk memudahkan keadaan tindak balas dan tindak balas pantas.Lu et al.[71] membangunkan SlipChip untuk analisis titisan, mampu menghasilkan titisan pelbagai saiz pada ketumpatan tinggi dalam satu langkah dan mengukur asid nukleik SARS-CoV-2 menggunakan LAMP digital (Rajah 7b).Sebagai teknologi yang berkembang pesat, CRISPR juga boleh memainkan peranan penting dalam pengesanan asid nukleik digital melalui pengimejan kolorimetrik yang mudah tanpa memerlukan kesan asid nukleik tambahan.Ackerman et al.membangunkan tindak balas matriks gabungan untuk penilaian multipleks asid nukleik.[158] mengesan 169 virus berkaitan manusia, termasuk SARS-CoV-2, dalam titisan yang mengandungi reagen pengesanan asid nukleik berasaskan CRISPR-Cas13 dalam ujian microwell (Rajah 7c).Selain itu, penguatan isoterma dan teknologi CRISPR boleh digunakan dalam sistem yang sama untuk menggabungkan faedah kedua-duanya.Park et al.[169] Ujian digital CRISPR/Cas12a telah dibangunkan dalam cip mikrofluidik komersial untuk pengesanan SARS-CoV-2 yang diekstrak dan dibunuh haba berdasarkan RT-RPA satu peringkat dengan pengesanan isyarat ke latar belakang yang lebih pendek dan lebih tinggi nisbah masa., julat dinamik yang lebih luas dan sensitiviti yang lebih baik (Rajah 7d).Beberapa penerangan tentang contoh ini diberikan dalam Jadual 3.
Platform digital biasa untuk pengesanan asid nukleik.a Aliran kerja PCR digital pantas terdiri daripada empat langkah utama: penyediaan sampel, pengedaran campuran tindak balas, proses penguatan dan kuantifikasi sasaran (diadaptasi daripada [164]).b Skema menunjukkan analisis titisan SlipChip untuk pembentukan titisan pada ketumpatan tinggi (diadaptasi daripada [71]).c Gambar rajah aliran kerja CARMEN-Cas13 (diadaptasi daripada [158]).d Gambaran keseluruhan pengesanan virus digital lanjutan dengan CRISPR/Cas dalam satu periuk (diadaptasi daripada [169]).Air-dalam-minyak W/O, polydimethylsiloxane PDMS, tindak balas rantai polimerase PCR, pengumpulan data DAQ, terbitan kamiran berkadar PID, tindak balas matriks gabungan CARMEN untuk penilaian asid nukleik berganda, SARS-CoV-2, sindrom pernafasan akut teruk, coronavirus 2 , RT Penguatan transkripase terbalik recombinase polimerase-RPA, isyarat S/B di latar belakang